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淋巴瘤是我国常见恶性肿瘤,可分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)两大类,我国淋巴瘤患者中约90%为非霍奇金淋巴瘤,而弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是NHL中最常见的亚型,约占全部NHL的30-40%。目前化疗仍然是治疗DLBCL的主要措施,但其整体5年生存率仍不足50%,临床上DLBCL难治的原因主要是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药,故研究DLBCL耐药机制是提高DLBCL患者疗效的关键。对化疗敏感性不同的DLBCL组织进行差异蛋白质组学分析,高通量地筛选凋亡及耐药相关蛋白,可望发现与化疗耐药相关的蛋白,为筛选肿瘤耐药的分子标志物及逆转耐药的靶向治疗提供新的思路。第一章化疗敏感性不同的DLBCL组织差异表达蛋白的蛋白质组学研究目的：本研究通过蛋白质组学方法分离鉴定CHOP方案化疗高敏感组和低敏感组的DLBCL组织的差异表达蛋白,为确定在淋巴瘤化疗增敏中其关键作用的分子以及化疗敏感性预测的标志物提供重要依据。方法：收集DLBCL新鲜组织标本,根据CHOP化疗药物敏感性试验分为化疗低敏感组和高敏感组,采用2-DE+MALDI-TOF-TOF-MS方法进行两组间差异蛋白质鉴定,获得了DLBCL化疗耐药相关蛋白差异表达谱,并对鉴定的差异表达分子进行生物信息学分析。对其中部分差异表达蛋白(EZR、PLEK、GSTP1和HSPB1)的表达水平进行Western Blot验证,观察这四种蛋白的表达与DLBCL的化疗敏感性的关系。结果：蛋白质组学方法获得了CHOP方案化疗高敏感组和低敏感组的DLBCL组织的差异蛋白表达谱,并鉴定了其中19个差异表达蛋白,包括：S100A9、醛脱氢酶1、膜联蛋白A5、埃兹蛋白(ezrin)、plecstrin (PLEK)、组蛋白H2A.2、4-kDa组氨酸磷酸酶、14-3-3ε、61-KD肿瘤相关抗原蛋白、胶原蛋白α1、血清铁蛋白、6-磷酸化葡糖酸内酯酶、Rab GDP解离抑制因子、冠蛋白样蛋白、人异质性胞核核糖核蛋白H3同工型a、前体RNA处理因子19、3-羟酰基辅酶A脱氢酶、谷胱甘肽S-转硫酶及热休克蛋白27。生物信息学分析显示这些蛋白功能涉及代谢相关酶,细胞通讯,细胞周期,免疫反应,应激反应,细胞结构,分子伴侣,基因稳定性,蛋白合成及转运等相关信号通路等,并且部分分子可能通过信号转导网络相互作用。进一步应用Western Blot对两组中四个蛋白EZR、 PLEK、GSTP1和HSPB1差异表达情况进行验证,结果显示EZR和PLEK在化疗高敏感组中的表达高于化疗低敏感组,而GSTP1和HSPB1在化疗高敏感组中的表达低于化疗低敏感组。证明蛋白质组研究结果有较好的重复性,所检测的四种蛋白在化疗敏感性方面具有重要意义。结论：1.2-DE结合质谱获得了DLBCL组织CHOP方案化疗耐药相关差异蛋白表达谱；2.获得了19个与DLBCL组织CHOP方案化疗耐药相关差异蛋白,这些蛋白功能涉及代谢相关酶,细胞通讯,细胞周期,应激反应,细胞结构,分子伴侣,基因稳定性,蛋白合成及转运等相关信号通路等,部分分子可能通过信号转导网络相互作用；3. EZR、PLEK、GSTP1和HSPB1经Western Blot验证与DLBCL化疗敏感性有关。第二章部分差异蛋白在化疗敏感性不同的DLBCL组织中表达的临床病理研究及HSP27表达对DLBCL化疗敏感性的影响目的：本研究进一步用免疫组织化学方法检测这四种蛋白在临床样本中表达的意义,并从体外细胞分子生物学水平探讨HSP27表达在弥漫性大B细胞淋巴瘤化疗敏感性中的作用及机制。方法：对蛋白质组学鉴定的部分差异表达蛋白(EZR、PLEK、 GSTP1和HSPB1)的表达水平进行IHC验证,观察这四种蛋白的表达与DLBCL的化疗敏感性的关系。进一步采用shRNA阻断HSP27表达后,Western Blot验证阻断效果并检测14-3-3ε的表达；检测Farage-LV-HSP27-shRNA细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的IC50值和耐药指数；流式细胞术检测阻断Farage细胞中HSP27的表达水平后,阿霉素、环磷酰胺、长春新碱对瘤细胞促凋亡相关作用效应的改变。结果：进一步用免疫组织化学方法检测这四种蛋白在临床样本中表达的意义,临床组织标本也根据化疗疗效分为化疗高敏感组和低敏感组,结果与蛋白质组学结果和Western Blot结果基本一致。证明蛋白质组学研究结果有较好的重复性,所检测的四种蛋白在化疗敏感性方面具有重要意义。采用shRNA阻断HSP27表达后,Western Blot验证其阻断有效；Farage-LV-HSP27-shRNA细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的IC50较对照细胞显著下降,表明HSP27表达下调可增加弥漫大B淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性；阻断HSP27表达的瘤细胞中凋亡率增加,而在加化疗药阿霉素、环磷酰胺、长春新碱后凋亡率增加更为明显,进一步证明了HSP27的下调能增加Farage细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的敏感性；本研究也发现阻断HSP27可引起14-3-3ε表达下调,提示HSP27介导化疗敏感性相关分子机制可能与14-3-3ε有关。结论：1.阻断HSP27表达可增加DLBCL细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的敏感性；2.14-3-3ε与HSP27的相互作用在弥漫性大B细胞淋巴瘤化疗敏感性中具有意义。