人参和丹参是我国著名的传统中药。人参具有大补元气、补脾固脱、安神益智等功效；丹参具有活血祛瘀、保护心脑血管等功效。人参皂苷是人参的主要活性成分,而丹酚酸是丹参水溶性物质中的主要活性成分。这些含量较高的活性成分(天然产物)分子量较大、难以被人体吸收,口服后在肠道中降解成低分子量的化合物,方可被吸收。然而,人体内的这种转化效率很低,大部分都被排泄到体外。因此,将中草药中含量高、活性低、吸收率较差的成分,在体外转化成活性高、易吸收的成分,对药品、保健食品、化妆品等行业意义巨大。为了得到高活性、易吸收的中药成分,本论文主要研究了Aspergillus niger g.848菌和Aspergillus niger g.48菌来源的两种人参皂苷酶I型(Ginsenosidase type-Ⅰ)对人参二醇类皂苷的3-O-和20-O-不同糖基的酶解机理和酶反应动力学；建立了利用A. niger g.848菌所产粗酶液转化价格较低的西洋参二醇类皂苷和三七叶皂苷,制备高活性人参稀有皂苷C-K、F2、C-Y、C-Mc、C-Mx方法。研究了Aspergillus oryzae D30s菌来源的新型丹酚酸酯酶的酶学性质,建立了,利用该丹酚酸酯酶酶转化丹酚酸B,制备高活性、小分子量丹参素和Przewalskinic acid A的方法。第一部分人参皂苷的生物转化为了从人参中含量高的二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd,制备高活性人参稀有皂C-K、F2、C-Y、C-Mc、C-Mx,本部分对以下内容进行了研究：①曲霉菌Aspergillus niger g.48、Aspergillus niger g.848经发酵培养,得到了两种人参皂苷酶I型的粗酶液；②两种人参皂苷酶I型的分离和纯化；③研究了两种人参皂苷酶I型的最适酶反应条件；④研究了两种人参皂苷酶I型的酶性质和酶反应动力学；⑤利用Aspergillus niger g.848菌所产人参皂苷酶,转化西洋参二醇类皂苷和三七叶皂苷,制备高活性、稀有人参皂苷C-K、F2、C-Y、C-Mc和C-Mx。首先,用来源于大曲的两种曲霉菌Aspergillus niger g.848、Aspergillus niger g.48进行发酵,经硫铵沉淀法得到粗酶液。再通过DEAE-纤维素-DE52阴离子交换树脂、切割PAGE凝胶条带法对这两种粗酶液进行了分离、纯化,得到了两种纯度超过95%的酶蛋白质,用SDS-PAGE法检测其分子量,分别为75 kDa、74 kDa。两种酶都能够水解人参二醇类皂苷3-O-和20-0-上的多种糖基,而不能够水解人参三醇类皂苷,均为人参皂苷酶I型。Aspergillus niger g.848菌所产的人参皂苷酶I型,命名为G-I-g.848; Aspergillus niger g.48菌所产的人参皂苷酶I型,命名为G-I-g.48。通过G-I-g.848酶和G-I-g.48酶的最适酶反应条件的研究,确定了这两种酶的最适反应温度均为45℃,最适pH均为5.0。分别研究了G-I-g.848酶和G-I-g.48酶,水解人参二醇类单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、 Rc、Rd、F2和20(S)-Rg3的3-O-和20-O-上不同糖基的酶解途径和酶反应动力学。G-I-g.48酶水解Rbl和Rb3时,能够同时水解其3-O-Glc、20-O-Glc或20-O-Xyl糖基,水解Rbl的两个途径分别是①Rb1→Gyp17→Gyp75→C-K途径；②Rb1→R→F2→C-K途径。水解Rb3的两个途径分别是①Rb3→C-Mx1→C-Mx→C-K途径；②Rb3→Rd→F2→C-K途径。G-I-g.48酶水解二醇类皂苷Rb2、Rc、Rd、F2、20(S)-Rg3时,均为单途径,与G-I-g.848水解Rb2、Rc、Rd、F2、20(S)-Rg3的途径相同。G-I-g.48酶水解二醇类皂苷的反应动力学米氏常数Km和最大反应速率Vmax如下：水解Rbl的3-O-Glc生成Gyp17的Km=14.6±0.4 mM,Vmax=19.1±1.8 mM/h水解Rbl的20-O-Glc生成Rd的；Km=15.4±0.3 mM,Vmax=65.4±6.2 mM/h；水解Rb2的3-O-Glc生成C-O的Km=6.53±0.6 mM,Vmax=24.5±2.5 mM/h;水解Rb3的3-O-Glc生成C-Mx1的Km=24.9±2.1 mM,Vmax=33.6±2.8 mM/h;水解Rb3的20-O-Glc生成Rd的Km=8.78±1.0 mM, Vmax=57.4±5.3 mM/h;水解Rc的3-O-Glc生成C-Mcl的Km=4.76±0.38 mM,Vmax=23.3±2.12mM/h；水解Rd的3-O-Glc生成F2的Km=0.79±0.06 mM,Vmax=11.84±1.3 mM/h;水解F2的3-O-Glc生成C-K的Km=1.13±0.12 mM,Vmax=3.75±0.36 mM/h；水解20(S)-Rg3的3-O-Glc生成20(S)-Rh2的Km=0.16±0.009 mM,Vmax=0.22±0.015 mM/h。在相同底物浓度(10 mM)下计算G-I-g.48酶水解人参二醇类皂苷的反应速度V0下：水解Rbl的水解Rbl的3-O-Glc的V0=7.75 mM/h,20-O-Glc的V0=25.7 mM/h;水解Rb3的3-O-Glc的V0=9.64 mM/h,水解Rb3的20-O-Xyl的V0=30.6 mM/h;水解Rb2、Rc、Rd、F2和20(S)-Rg3的3-O-Glc的V0次为14.8 mM/h,15.9 mM/h、11.0 mM/h、3.37 mM/h、0.22 mM/h。因此G-I-g.48酶水解上述人参二醇类皂苷糖基的水解速度从快到慢依次为：水解Rb3的20-O-Xyl (Rb3→Rd途径)>Rbl的20-O-Glc (Rb1→Rd途径)>Rc的3-O-Glc>Rb2的3-O-Glc>Rd的3-O-Glc>Rb3的3-O-Glc (Rb3→C-Mx1途径)>Rbl的3-O-Glc (Rb1→Gyp17途径)>F2的3-O-Glc>20(S)-Rg3的3-O-Glc。G-I-g.848酶能够同时水解二醇类皂苷Rb3的3-O-Glc和20-O-Xyl,两个水解途径分别是①Rb3→C-Mx1→C-Mx→C-K途径,该途径为主要水解途径；②Rb3→Rd→F2→C-K途径。该酶水解其他二醇类皂苷,Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、20(S)-Rg3时,均为单途径：水解Rbl时,先水解其20-O-Glc,再水解其3-O-Glc,水解途径为Rb1→Rd→F2→C→K;水解Rb2和Rc时,先水解其3-O-Glc,再水解其20-O-Ara,水解途径分别为Rb2→C-O→C-Y →C-K、Rc→C-Mcl→C-Mc→C-K;水解Rd、F2、20(S)-Rg3时,水解其3-O-Glc,水解途径分别为Rd→F2→C-K、F2→C-K、20(S)-Rg3→20(S)-Rh2→Ppdiol。G-I-g.848酶水解二醇类皂苷的反应动力学米氏常数Km和最大反应速率Vmax如下：水解Rbl的20-O-Glc生成Rd的Km=16.6±1.6 mM,Vmax=79.6±7.5 mM/h;水解Rb2的3-O-Glc生成C-O的Km=20.4±2.1 mM,Vmax=45.6±4.62 mM/h;水解Rb3的3-O-Glc生成C-Mx1的Km=15.1±1.4 mM,Vmax=10.8±1.1 mM/h;水解Rb3的20-O-Glc生成Rd的Km=15.1±1.4mM,Vmax=1.62±0.17 mM/h;水解Rc的3-O-Glc生成C-Mcl的Km=5.46±0.41 mM,Vmax= 6.16±0.63 mM/h;水解Rd的3-O-Glc生成F2的Km=0.603±0.04 mM,Vmax=1.19±0.11 mM/h;水解F2的3-O-Glc生成C-K的Km=1.25±0.11mM,Vmax=3.02±0.30 mM/h;水解20(S)-Rg3的3-O-Glc生成20(S)-Rh2的Km=0.358±0.019 mM,Vmax=0.056±0.0043 mM/h。在相同底物浓度(10 mM)下计算酶反应速度V0,可以判断G-I-g.848酶水解各二醇类皂苷不同位置、不同糖基水解速度,该酶水解各皂苷的酶反应速度(V0)如下：水解Rb3的3-O-Glc的V0=4.307 mM/h,水解Rb3的20-O-Xyl的V0=0.644 mM/h;水解Rbl、Rb2.Rc.Rd.F2和20(S)-Rg3的3-O-Glc的V0依次为29.9 mM/h,15.0 mM/h,3.98 mM/h, 1.12 mM/h,2.68 mM/h,0.054 mM/h。因此,G-I-g.848酶水解上述人参二醇类皂苷糖基的水解速度从快到慢依次为：水解Rbl的20-O-Glc>Rb2的3-O-Glc>Rb3的3-O-Glc (Rb3→C-Mx1途径)>Rc的3-O-Glc>F2的3-O-Glc>Rd的3-O-Glc>Rb3的20-O-Xy1 (Rb3→Rd途径)>20(S)-Rg3的3-O-Glc。将G-I-g.848酶和G-I-g.48酶进行比较：这两种酶均能水解人参二醇类皂苷的3-O-和20-0-位置的多种糖基；但在水解途径和水解速度上有差异：G-I-g.848酶经单途径水解Rbl,先水解Rbl的20-0-位置的末端糖基,然后水解其3-O-位置的末端糖基；G-I-g.48酶经两个途径水解Rbl,同时水解Rbl的3-O-和20-0-位置的末端糖基。G-I-g.848酶水解二醇类皂苷3-O-糖基的速度大于水解20-0-糖基的速度(除Rb1外)；而G-I-g.48酶水解20-0-糖基速度大于水解3-O-糖基速度。根据G-I-g.848酶和G-I-g.48酶的酶反应动力学的研究结果可知,通过控制反应时间和底物浓度,可改变各稀有皂苷的生成量,按实际需求,制备稀有皂苷C-K、F2、C-Y、C-Mc、C-Mx。本实验为了同时大量制备上述稀有人参皂苷,选用G-I-g.848酶,转化价格较低的西洋参二醇类皂苷(主要含有Rb1、Rb2、Rc、Rd)制备人参稀有皂苷F2、C-Y、C-Mc、C-K；转化价格较低的三七叶皂苷(主要含有Rb3、C-Mx1),制备人参稀有皂苷C-Mx和C-K。两种底物的浓度均为3%,分别在45℃、pH5.0条件下反应18 h后,结果,从80 g的西洋参二醇皂苷制备了50 g的人参稀有皂苷混合品,又经硅胶柱分离,成功得到5.20 g C-Mc,0.96 g C-Y,16.3 g F2和16.9 g C-K等4种单体皂苷,经HPLC检测,纯度均高于90%。其中,从Rc转化得到的C-Mc的摩尔得率为43.7%,从Rb2得到的C-Y的摩尔得率为42.4%,从Rbl和Rd得到的F2和C-K的摩尔得率为69.5%。从50g三七叶皂苷制备了31.0 g的人参稀有皂苷混合品,经硅胶柱分离,成功得到了9.43 g C-Mx,5.45g C-K,纯度均大于95%。从Rb3和C-Mx1转化得到的C-Mx的摩尔得率为48.2%,从其他皂苷转化得到的C-K的摩尔得率为41.2%。第二部分丹参中含量高的丹酚酸的生物转化为了得到高活性、水溶性小分子丹参成分Przewalskinic acid A和丹参素,本部分对以下内容进行了研究：①曲霉菌Aspergillus oryzae D30s经发酵培养,得到了丹酚酸酯酶的粗酶液,并对产酶条件进行了优化；②粗酶液经分离、纯化,得到了两种丹酚酸酯酶；③研究了丹酚酸酯酶E1的酶性质；③利用丹酚酸酯酶粗酶液转化丹酚酸B,制备了高纯度单体丹参素和Przewalskinic acid A。用曲霉菌Aspergillus oryzae D30s进行发酵,发酵液离心后,经硫铵沉淀,得到了粗酶液。A. oryzae D30s菌的最适产酶条件为：以1.0%丹参水提液为诱导物,在含5%麦芽汁液体培养基中,40℃、摇床培养96 h。再通过DEAE-纤维素-DE52阴离子交换树脂进行纯化,利用切割非变性的PAGE条带法对这两种粗酶液进行了进一步纯化,得到了两种纯度超过95%的酶蛋白质,其分子量分别为36 kDa、65 kDa。这两种丹酚酸酯酶均能水解丹酚酸B。本论文主要研究了分子量为36 kDa的丹酚酸酯酶E1的酶性质,其最适酶反应pH=5.0,最适酶反应温度为40℃；丹酚酸酯酶E1具有底物专一性,能水解丹酚酸B的酯键,但不能水解pNPP酯键,这不同于在NC-IUBMB (http://www.chem. qmul.ac.uk/iubmb/)上已被报道的酯酶,是一种新型的酯酶。用Aspergillus oryzae D30s菌所产的丹酚酸酯酶的粗酶液,转化丹酚酸B制备高活性的丹参素和Przewalskinic acid A。在底物浓度1.6%、pH5.0、40℃的条件下,反应14 h,回收酶,产物经Sepabeads SP207大孔吸附树脂柱分离纯化,得到了两种酶解产物单体：从75 g丹酚酸B,得到13.1 g纯度为95%的丹参素,31.3 g纯度为91.0%的Przewalskinic acidA；其中Przewalskinic acid A的摩尔得率为86%,制备非常成功；但是,丹参素的摩尔得率仅为33%,还有待于进一步的改进。我们采用超高效液相色谱-质谱联用法和核磁共振分析核对了酶反应产物丹参素和Przewalskinic acid A的结构。综上,本文研究了两种菌来源的人参皂苷酶I型和一种新的丹酚酸酯酶,阐明了这些酶的酶学性质,建立了利用粗酶液转化人参二醇类皂苷,制备高活性人参稀有皂苷C-K、F2、C-Y、C-Mc、C-Mx的方法；建立了从丹酚酸B制备高活性小分子酚酸类化合物Przewalskinic acid A和丹参素的方法。为今后人参制品、药品、相关保健品和化妆品以及丹参类药物的开发提供理论依据。