阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要的病理特征包括：以β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉积为核心形成的老年斑(senileplaques，SPs)，以超磷酸化的Tau蛋白为核心形成的神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)及神经细胞丢失等。在对AD发病机制的研究中，Aβ一直是研究中的热点和焦点，大量的研究认为，Aβ诱导的神经元凋亡及Tau蛋白磷酸化与AD的发病密切相关。因此，研究Aβ诱导细胞凋亡及Tau蛋白磷酸化的作用机制对AD发病机制的研究具有重要的意义。促红细胞生成素(Erythropoietin，Epo)是一种可调节红细胞生成的细胞因子。然而，近年来的研究发现，Epo及其功能受体(Erythropoietinreceptor，Epo-R)在神经系统中也有表达，且具有广谱的神经保护功能。Epo与其受体Epo-R结合后，可激活Jak2，对几种下游信号传导通路进行调节，从而发挥其多种生理功能。PI3K是Jak2的下游靶激酶，参与了神经系统的发育、保护、学习和记忆等多种生理功能。Akt是PI3K信号转导通路中一个下游靶激酶，是重要的抗凋亡调节因子。糖原合成激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)是PI3K/Akt的下游底物，活化的Akt能诱导GSK-3β在丝氨酸Ser9位点的磷酸化，下调GSK-3β的活性，而GSK-3β与AD中Tau蛋白的磷酸化有密切关系。近来研究发现，随着年龄的衰老，Epo在大鼠脑皮层和海马的免疫反应性逐渐下降，提示Epo免疫反应性的下降可能与一些与衰老相关的神经变性疾病，如AD等的发病有关。本研究采用凝聚态Aβ25-35作用于细胞，建立Aβ25-35诱导的细胞损伤模型，并用Epo进行治疗，观察Epo对Aβ诱导的细胞损伤特别是细胞凋亡及Tau蛋白磷酸化的影响，并明确其作用机制，旨在为AD的发病机制及治疗探求新的途径。本研究共分为以下四个部分： 第一部分：Ap诱导细胞凋亡中P13K/Akt信号传导通路的变化。首先采用MTT法检测不同浓度的Aβ25-35作用24h后及20μmol/LAβ25-35作用不同时间后PC12细胞活力的变化；再采用AnnexinV-PI双染色法观察20μmol/LAβ25-35作用不同时间后细胞凋亡情况；采用Westernblotting法观察p-Akt及p-GSK-3βSer9的表达情况。结果发现：不同浓度的(1、2、5、10、20、50μmol/L)Aβ25-35作用24h后均可引起PC12细胞活力的下降(P＜0.05)，且随着作用浓度的增加，该作用逐渐增强；20gmol/LAβ25-35作用不同时间(30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h)后均可引起PC12细胞活力的下降及细胞凋亡(P＜0.05)，且随着作用时间的延长，该作用逐渐增强；Westernblotting结果发现，Aβ25-35作用于细胞30min及1h后，p-Akt及p-GSK-3βSer9的表达均出现迅速的下调(P＜0.05)，在作用3h时，p-Akt及p-GSK-3βSer9的表达均出现迅速的上升(P＜0.05)，在6h时又出现两者的表达下调(P＜0.05)；在12h时p-Akt表达又逐渐上升，但在48h时仍没有达到正常水平；而p-GSK-3βSer9在Aβ25-35作用12h时表达出现了迅速的上升(P＜0.05)，而后逐渐恢复到正常水平。 第二部分：促红细胞生成素对Aβ诱导细胞凋亡的保护作用。首先采用不同浓度的凝聚态Aβ25-35作用于PC12细胞24h后，观察细胞活力的变化，进而选择出单一浓度的Aβ25-35诱导细胞凋亡，观察Epo对Aβ诱导的细胞凋亡的保护作用，并选用P13K/Akt抑制剂LY294002研究其作用机制。结果发现，不同浓度的Epo(5、10、20U)对20μmol/LAβ25-35诱导的细胞活力的下降均具有保护作用(P＜0.05)；Hoechst33258核染色结果发现，20μmol/LAβ25-35作用细胞24h后细胞凋亡现象增加，不同浓度的Epo(5、10、20U)对20μmol/LAβ25-35诱导的细胞凋亡均具有保护作用(P＜0.05)；Westernblotting结果也发现，20μmol/LAβ25-35作用细胞24h后，Bax/Bcl-2的比值明显增加(P＜0.05)，Cleavedeaspase-3和CleavedPARP的表达也明显增加(P＜0.05)；不同浓度的Epo(5、10、20U)对20μmol/LAβ25-35诱导的这些指标的变化均具有抑制作用(P＜0.05)；应用PI3K/Akt抑制剂LY294002(50μmol/L)后，Epo对Aβ25-35诱导的细胞凋亡的保护作用消失了(P＜0.05)。 第三部分：Aβ诱导细胞Tau蛋白磷酸化。首先观察20μmol/LAβ25-35作用于SH-SY5Y细胞不同时间点后，细胞Tau蛋白在Ser199，Ser396位点磷酸化水平及总Tau蛋白的表达；再选用GSK-3β抑制剂LiCL研究其作用机制。结果发现，20μmol/LAβ25-35作用于细胞不同时间点后(0、30min、1h、3h、6h、12h、24h)，Tau蛋白在Ser199、Ser396位点的磷酸化水平在作用后3h逐渐增加(P＜0.05)，6h达到最高峰(P＜0.05)，12h后又逐渐下降(P＜0.05)，而Aβ25-35对总的Tau蛋白的表达的影响不具有统计学意义(P＞0.05)；GSK-3β抑制剂LiCL(20mmol/L)可抑制Aβ25-35诱导的Ser396、Ser199位点的磷酸化(P＜0.05)，提示GSK-3β参与了Aβ25-35诱导的Tau蛋白磷酸化的过程。我们又进一步研究LiCL的作用机理发现，LiCL可通过诱导GSK-3β的失活形式p-GSK-3βSer9的表达增加从而抑制GSK-3β活性。 第四部分：Epo对Aβ诱导的细胞Tau蛋白磷酸化的影响。采用20μmol/LAβ25-35作用于SH-SY5Y细胞，观察Epo对Aβ诱导的细胞Tau蛋白磷酸化的影响，并选用MAPK抑制剂PD98059及PI3K/Akt抑制剂LY294002研究其作用机制。结果发现：20μmol/L的Aβ25-35可使Tau蛋白在Ser396、Ser199位点的磷酸化水平增高(P＜0.05)、p-Akt及p-GSK-3βSer9的表达降低(P＜0.05)；Epo可显著抑制Aβ25-35诱导的Tau蛋白在Ser396、Ser199位点的磷酸化水平增高(P＜0.05)，并可诱导p-Akt及p-GSK-3βSer9的表达增高(P＜0.05)；MAPK抑制剂PD98059(50μmol/L)对Epo作用的影响不具有统计学意义(P＞0.05)；而P13K/Akt抑制剂LY294002(50μmol/L)在抑制p-Akt(P＜0.05)及p-GSK-3βSer9表达的同时，对Epo的作用也具有抑制作用(P＜0.05)。 本文的研究结果表明：1.Aβ25-35可诱导细胞凋亡，PI3K/Akt信号传导通路参与了Aβ25-35诱导的细胞凋亡。2.Aβ25-35可诱导细胞Tau蛋白的磷酸化，GSK-3β参与了Aβ25-35诱导的Tau蛋白磷酸化。3.Epo可有效地抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡及Tau蛋白磷酸化，这种抑制作用是通过激活PI3K/Akt信号传导通路实现的。4.本研究为深入研究Epo的神经保护功能及AD的发病机制和防治提供了重要的理论基础和实验依据。