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桂花(Osmanthus fragrans Lour.)属于木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)植物。作为中国十大传统名花之一,香气独特,不仅广泛应用于古代园林以及现代园林的植物造景中,而且被列为重要的天然保健和香料植物,应用于香料及食品加工产业和芳香疗法。桂花依据花色和花期的不同,分为银桂、金桂、丹桂和四季桂四个品种群。丹桂品种群的花色最深,以橙色为主调,一般认为,其感知的香味不及黄色调的金桂和白色调的银桂,且同一品种群中不同品种的花香也存在一定的差异。前人从香气与色素物质的理化成分上对桂花的花香与花色进行了初步的研究,但其色香形成及其关系的分子机理尚未见报道。萜类物质既是桂花花香的主要成分和重要香气活性物质,也是花色的重要组成部分,但有关其生物合成代谢机理的研究并不多。本研究分离克隆与桂花花香、花色合成相关的基因,分析主要香气和色素物质代谢路径基因的转录水平,寻找控制桂花色香形成的关键基因,从分子水平对桂花色香形成的机理进行了探讨,为桂花的色香调控及分子育种奠定基础。主要研究结果如下:1.不同发育时期桂花花瓣和幼叶的cDNA-AFLP分析以’柳叶金桂’为材料,采用cDNA-AFLP技术对其花瓣不同发育时期和幼叶进行分析,共获得283条不同的差异表达基因片段。其中150条差异基因片段有相应的功能注释,根据参与的生物过程被分为10大类,包括代谢、发育、衰老、抗性以及转录调控等。其中参与次生代谢、转录调控和发育这三类生物过程的基因为我们研究桂花花香与花色奠定了基础。2.丹桂和金桂花香的释放与积累比较以’镉橙丹桂’和’柳叶金桂’为材料,比较了二者的挥发性花香物质成分,并对其主要单萜物质的释放与积累规律进行了分析。实验结果表明,’镉橙丹桂’和’柳叶金桂’花瓣挥发性花香物质的成分及含量存在较大差异。’镉橙丹桂’以单萜类物质为主,存在少量的类胡萝卜素衍生香气物质;而’柳叶金桂’以类胡萝卜素衍生香气物质为主,只含少量的单萜类物质。另外还发现,单萜物质的释放与积累受花发育时期以及昼夜节律的调控,以糖苷化形式积累的单萜物质对花香物质的释放起着重要的调节作用。3.参与单萜代谢基因的转录水平分析以‘镉橙丹桂’和’柳叶金桂’为材料,对参与单萜代谢的MEP代谢路径及萜合酶共18个基因在不同发育时期的转录水平进行了分析。实验结果表明,两个品种在整个开花时期MEP代谢路径上的基因表达量差异较小或者与单萜合成不一致;而参与单萜合成最后一步酶反应的萜烯合酶(TPS)基因,尤其是OfTPS1和OfTPS3,在’镉橙丹桂’中的表达量要明显高于’柳叶金桂’,与单萜的合成保持一致。4.萜烯合酶(TPS)基因的克隆与功能分析通过RACE-PCR方法,从桂花中克隆TPS基因的全长,从中获得4个具有完整开放阅读框的TPS基因。由这4个基因编码的蛋白具有高度保守的氨基酸基序:DDxxD 结构域和(N,D)D(L,I,V)x(S,T)xxxE 结构域。其中,仅OfTPS4在N-末端具有RR(x)8W结构域。系统进化树分析将OfTPS1和OfTPS2归为TPS-g亚家族,而OfTPS3和OfTPS4被聚为TPS-b亚家族。瞬时和稳定的基因超表达结果表明,OfTPS1和OfTPS2为芳樟醇合酶,OfTPS3和OfTPS4分别为(E)-β-罗勒烯合酶和α-法呢烯合酶。5.参与类胡萝卜素代谢基因的转录水平分析以’镉橙丹桂’和’柳叶金桂’为材料,对参与类胡萝卜素合成、转化和裂解代谢的共18个基因在铃梗期和盛花期的转录水平进行了分析。实验结果表明,在类胡萝卜素合成代谢中,只有PDS1、CRTISO、LCYB1在两个品种的盛花期的表达量要高于铃梗期,且在类胡萝卜素积累较多的’镉橙丹桂’中的表达量更高。在类胡萝卜素转化代谢中,CHYE在’柳叶金桂’铃梗期的表达量较高,在盛花期表达量明显下降,而该基因在’镉橙丹桂’的两个开花阶段的表达量差异并不大;ZEP在盛花期的表达量高于铃梗期,且类胡萝卜素积累更多的’镉橙丹桂’中表达量更高;VDE基因的表达恰好与ZEP相反,在积累玉米黄质的’柳叶金桂’的铃梗期表达量更高。在类胡萝卜素裂解代谢中,NCED1和CCD4a的表达量都表现为盛花期高于铃梗期,且相同时期’柳叶金桂’中的表达量更高;NCED2在两个品种的表达量存在差异,但是变化趋势不一致;CCD1和CCD4b在两个品种的表达量差异并不不明显。6.类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)基因的克隆与功能分析通过RACE-PCR方法,从桂花中获得3个具有完整开放阅读框的CCD基因。其中,OfCCD4b是还未报道过的新基因,OfCCD1和OfCCD4a与已报道的桂花中的CCD1和CCD4具有高度的同源性。三个OfCCD基因在不同组织部位及品种中具有不同的表达模式。OfCCD1和OfCCD4a在花瓣中的表达量最高;OfCCD4b主要在花梗、花托和雌蕊中表达。原核体内和体外酶反应结果表明,OfCCD1能降解大多数的类胡萝卜素产生相应的类胡萝卜素衍生香气物质;OfCCD4a不能降解这些类胡萝卜素产生香气物质,但是在积累玉米黄质的菌株产生了新的类胡萝卜素;OfCCD4b在积累类胡萝卜素的菌株中表达,则既不能产生香气物质,也不能产生新的类胡萝卜素。