第一部分基于关节力学失稳的方法建立兔膝骨关节炎模型的实验研究　　目的:探索兔膝骨关节炎模型的建立方法并评价模型质量。　　方法:将24只新西兰大白兔随机分为正常对照组、模型4周组和模型8周组。模型组动物采用手术切断内侧副韧带并切除部分髌韧带的方法造模;正常对照组仅切开皮肤，显露上述结构而不做特殊处理。分别于造模后4周、8周时处死动物，取血清样本测试IL-1β、TNF-α、MMP-13的浓度;肉眼观察实验动物膝关节的大体形态，关节标本常规脱钙后，做病理切片并行HE染色，镜下观察软骨组织形态结构，同时应用Mankin评分标准评价关节软骨退变情况。对以上各项血清观察指标及Mankins分值进行统计学分析，比较各组间差异。　　结果:模型4周和模型8周组的关节软骨标本分别呈现出不同程度的退变表现，两组的Mankin评分结果均明显高于正常对照组;与正常对照组比较，模型4周组、模型8周组动物血清中IL-1β、TNF-α、MMP-13水平均升高，差异具有统计学意义。　　结论:采用切断内侧副韧带并切除部分髌韧带的方法造模，可获得较为理想的兔膝骨关节炎早中期模型，且操作简单、感染率和死亡率低。　　第二部分手法对兔膝骨关节炎软骨退变的抑制作用及对MAPK信号转导通路的影响　　目的:观察中医手法对实验性兔膝骨关节炎软骨退变的抑制作用，并从细胞信号转导角度探讨其作用机制。　　方法:32只新西兰大白兔随机分为4组，即正常组、模型组、跑台组和手法组，除正常组外，其余三组动物均采用实验一部分所述的方法建立膝骨关节炎模型。造模四周后开始对各组动物实施不同的干预:手法组给予髌骨按揉、关节被动屈伸等形式的手法治疗，跑台组于动物实验跑台上进行主动活动，正常组和模型组按常规方式饲养，不予特殊处理。8周后，处死实验动物，截取膝关节，肉眼观察其外观形态;取膝关节股骨髁部，做病理切片并行HE、Alcianblue& Orange G(AB&OG)染色，显微镜下观察关节软骨的组织病理学特征，并进行Mankind评分，比较各组动物关节软骨退变状况;另外取滑膜组织和关节软骨组织标本，应用RT-PCR的方法检测滑膜组织中IL-1β、iNOS及MMP-13的mRNA表达，测定关节软骨组织中P38、ERK1/2的基因表达水平;应用Western-blot方法检测软骨组织内MMP-13及磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表达情况。比较各组实验数据并进行统计学分析。　　结果:组织病理学观察结果显示，手法组关节软骨退变程度较模型组和跑台组明显减轻，Mankins评分的分值显著低于以上两组。软骨组织RT-PCR的结果显示，与正常对照组比较，模型组的及跑台组的P38、ERK1、ERK2的mRNA相对表达量明显上调;而手法组P38、ERK1、ERK2三项指标的mRNA表达水平较模型组和跑台组显著下调。滑膜组织RT-PCR的检测与分析结果显示，与正常对照组比较，模型组及跑台组IL-1β、iNOS、MMP-13的mRNA表达水平明显上调;与模型组、跑台组比较，手法组的IL-1β、iNOS、MMP-13的基因表达水平显著下调。Western-blot的测定结果显示模型组、跑台组和手法组的MMP-13、p-ERK1/2的蛋白表达较正常关节软骨明显增强，而手法组MMP-13、p-ERK1/2的蛋白活化程度与模型组和跑台组比较明显受到抑制。　　结论:中医手法能够有效抑制膝骨关节炎的软骨退变程度，影响炎症介质和细胞因子的表达，其机制可能是通过抑制软骨MAPK信号转导通路发挥作用。　　第三部分力学刺激对IL-1 B诱导的软骨细胞退变及MAPK信号转导通路的影响　　目的:观察机械性力学刺激对受损软骨细胞的生化代谢和MAPK信号转导通路的影响，揭示软骨细胞的生物力学特性，探索力学刺激在软骨损伤修复中的作用机制。　　方法:体外分离培养兔关节软骨细胞，传代后接种于Flexcell细胞培养板，并随机分为七组:空白对照组，IL-1β诱导组，压力干预组（包括P1、P2、P3、P4、P5组），除对照组外，其余各组均加入10ng/ml的IL-1β以诱导软骨细胞的损伤和退变。压力组参照体内试验的手法力学数据以Flexcell细胞组织力学加载系统实施力学干预，压力参数为3N，2.36HZ，每组分别加载0.5h，2h，8h，16h和24h。干预结束后，收集各组软骨细胞的上清液和细胞悬液，细胞上清液以ELISA方法测定糖胺多糖(GAG)的水平，细胞悬液提取RNA后应用实时定量PCR(QRT-PCR)方法检测各组P38MAPK、ERK1、JNK1、整合素α5、β1、MMP-13和Ⅱ型胶原(Collagen TypeⅡ)的mRNA的表达，对各组数据进行统计学分析。　　结果:ELISA测定结果显示，与IL-1β诱导组比较，经周期性机械压力干预后，各组软骨细胞上清液中GAG水平明显升高，差异具有统计学意义;与压力干预时间为0.5h的P1组比较，其余压力组的GAG表达水平升高更为显著;其中压力作用16h的P4组GAG数值最高，但与P2，P3及P5压力干预组相比，差异无统计学意义。qRT-PCR测定结果显示，软骨细胞加入IL-1β诱导后，与空白对照组比较，P38 MAPK、ERK1、整合素α5、β1、MMP-13的mRNA表达水平明显上调;与IL-1β诱导组比较，压力加载后各组P38、ERK1、JNK1、整合素α5β1及MMP-13的mRNA表达水平下调，差异具有统计学意义;而Ⅱ型胶原的基因表达水平在压力加载后则不同程度增高。　　结论:　　1.适宜的周期性机械应力能够促进软骨细胞中糖胺多糖和Ⅱ型胶原的合成，抑制炎症环境下MMP-13的分泌，从而调节软骨细胞的生化代谢功能，抑制软骨基质的破坏和降解。　　2.力学刺激通过影响软骨细胞微环境中整合素的表达及其介导的MAPK信号转导通路发挥调节软骨细胞基质代谢的作用。