论文部分内容阅读
VHL(Von Hippel-Lindau syndrome,VHL)综合征即小脑视网膜多发毛细血管瘤,是一种常染色体显性遗传的家族性肿瘤综合征,受累患者可在不同器官出现多种肿瘤,常见有脑血管母细胞瘤、视网膜血管母细胞瘤、胰腺囊肿、肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)和(或)多发性肾囊肿以及肾上腺嗜铬细胞瘤等,其中中枢神经系统血管母细胞瘤和肾细胞癌危害最大。VHL综合征的发病率为1/50,000-36,000,发病年龄差异很大,肾细胞癌(RCC)是最常见的致死原因,患者平均生存期为49岁。VHL综合征的致病基因是VHL基因。VHL基因是一种肿瘤抑制基因,定位于染色体3p25-26,全长4.5kb,含有3个外显子,开放阅读框(openreading frame,ORF)由852个核苷酸组成,编码284个氨基酸残基。VHL蛋白(VonHipple-Lindau Protein,pVHL)在血管肿瘤的发生、调节细胞生长相关基因的表达、调控细胞周期等方面起至关重要的作用。VHL综合征中VHL基因突变率为75%左右,主要突变类型为点突变,占72%左右;其次为拷贝数减少,占28%左右。检测VHL综合征家系中VHL基因突变对于指导临床诊断尤其是产前诊断及遗传咨询具有重要意义。佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease,PMD)是一种遗传性脑白质营养不良病,又名皮层外型中轴发育不良或先天性皮质外轴索再生障碍症,是X连锁隐性遗传病,多见于男性,女性多为携带者,眼球震颤为最常见的临床表现。研究证实PMD是由X染色体上蛋白脂蛋白1(Proteolipid Protein 1,PLP1)基因突变引起蛋白脂蛋白1(Proteolipid Protein 1,PLP1)缺陷所致。PLP1基因位于染色体Xql3-22,全长约17kb,包含7个外显子。由于mRNA的不同剪接和转录,翻译成两种蛋白质:PLP1和DM20。PLP1较DM20多35个氨基酸,这35个氨基酸构成PLP1特异性区域(specialdomain)。PLP1是中枢神经系统主要髓鞘膜蛋白,约占50%。PLP1基因突变是高度变异的,主要类型有拷贝数增加、点突变和拷贝数减少,其中拷贝数增加占所有突变类型的60%-70%,被认为是PMD的主要病因。点突变占15%-20%,大多分布在PLP1基因的编码区,无突变热点。PLP1基因检测对于指导遗传咨询及产前诊断具有重要的临床应用价值。本文对一中国4代25人的VHL综合征家系进行了VHL基因突变检测,同时对6例临床诊断为PMD的患儿进行了PLP1基因突变分析研究,以期找到患者致病基因突变。材料与方法一、实验材料VHL综合征家系,采自辽宁省。PMD患儿6例,男性,6个月-15岁,由中国医科大学附属二院发育儿科提供外周血样及相关病例资料。1例正常男性作为本研究的正常对照,无VHL综合征和PMD病史及家族史。二、方法(一)、提取基因组DNA采用常规酚-氯仿方法或Blood GenomicPrep Minispin kit(GE,美国)提取VHL综合征家系成员、PMD患儿及正常对照者的外周血基因组DNA。(二)、PCR-DNA测序技术检测VHL基因和PLP1基因点突变针对VHL基因和PLP1基因的外显子设计引物,PCR扩增VHL基因和PLP1基因全部编码序列。对PCR产物进行DNA片断纯化回收,采用Beckman CEQ-8000遗传分析仪进行测序分析,检测是否存在基因编码区点突变。(三)、实时定量PCR技术检测VHL基因和PLP1基因拷贝数变异采用SYBR荧光染料法。针对VHL基因外显子3和PLP1基因外显子1、3、4、7分别设计PCR引物;内参基因为Hsa21基因;1例无VHL综合征和PMD病史及家族史的正常男性作为正常对照。采用△△Ct法进行数据处理,分析VHL基因和PLP1基因相对拷贝数的变化。结果一、VHL综合征家系VHL基因突变分析结果实时定量PCR结果表明,相对于正常对照该家系的4名患者VHL基因相对拷贝数均在0.5左右,小于0.75,说明VHL基因拷贝数减少。而在该家系的正常人中,VHL基因相对拷贝数均接近于1,没有拷贝数变异。基因测序未检测到VHL基因编码区点突变。二、PMD患者PLP1基因突变分析结果(一)实时定量PCR检测结果6例PMD男性患儿中,1例患儿PLP1基因相对拷贝数接近于2,此病例PLP1基因拷贝数增加,为2个拷贝。其余5例患儿PLP1基因相对拷贝数均接近于1,这5例患儿PLP1基因拷贝数是正常的。(二)PCR-DNA测序检测结果对于实时定量PCR没有检测到PLP1基因拷贝数变异的5例患儿,应用了PCR-DNA测序技术检测PLP1基因的点突变。分析结果:在这5例患儿中均未发现PLP1基因编码区的点突变。结论1、应用实时定量PCR技术检测到VHL综合征家系患者VHL基因拷贝数减少。2、应用实时定量PCR方法在6例佩-梅病患儿中检测到1例PLP1基因重复突变。3、采用实时定量PCR未检测到PLP1基因拷贝数变异的佩-梅病病例,又采用PCR-DNA测序方法进行检测,但未检测到PLP1基因编码区点突变。