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随着人们生活方式的改变和人口老龄化,血管钙化发病率持续上升,是动脉粥样硬化、糖尿病、终末期肾病和老化的一种常见病理状态,加剧了心血管相关死亡。目前研究证实:血管钙化和心血管高并发症是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的两个重要特点,大多数观察性研究发现血管钙化与CKD呈正相关。矿物质代谢失调、循环钙离子和磷酸盐水平升高是CKD中血管钙化发生发展的关键因素。积极预防和治疗血管钙化对于降低CKD和糖尿病患者心血管不良事件发生率具有重要意义。然而积极地进行血液透析并不能延缓血管钙化的发生发展,治疗CKD、心血管疾病的药物亦未发现能够有效地抑制血管钙化。虽然临床上关于血管钙化对疾病预后影响的观察研究已有很多,但对于血管钙化发生及进展过程中细胞、分子水平的机制的基础研究尚处于起始阶段,亟需进行更加深入地研究,来明确血管钙化的发生机制,从而进行有效的防治。既往的研究发现血管钙化的发生不仅是简单的钙盐沉积,而是一个多种机制一同参与的复杂的调节过程。其中包括（1）血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）的表型转换,VSMC会失去原有的收缩表型标志物钙结合蛋白（Calponin）等,表达成骨表型标志物 RUNX2（Runt-related transcription factor2,RUNX2）等;（2）细胞凋亡,基质囊泡的释放;（3）促进钙化与抑制钙化的蛋白平衡失调;（4）细胞自噬;（5）氧化应激,内质网应激等。Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）是Hippo通路的直接下游效应因子,可以作为转录共激活因子与TEA结构域转录因子（TEA domain transcription factor,TEAD）、RUNX2等转录因子相互作用调节靶基因的表达,是多个器官发育及体积控制的主要调节器。近期研究发现Hippo-YAP信号通路可能参与了骨形成及成骨分化的病理生理过程,YAP在应答Src刺激时可作为RUNX2的共抑制因子抑制间充质干细胞的成骨分化;YAP还可参与Wnt通路等成骨分化经典信号通路促进成骨分化。鉴于YAP与成骨分化的过程有关,而血管钙化的发生又类似于骨形成及成骨分化过程,因此我们推测YAP可能参与了血管钙化的调控过程。自噬是指细胞降解错误折叠的蛋白质、老化的细胞器等细胞内废物进行能量再利用的过程。研究表明在高磷刺激下,自噬作为一种保护性的反应会显著升高,升高的自噬又可以通过抑制基质囊泡的释放来抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。YAP与自噬关系的研究目前主要集中在肿瘤领域,在人卵巢癌细胞中,YAP可以通过增强细胞的自噬流来诱导顺铂耐药,进而增强这些细胞的增殖,侵袭,迁移等;在胶质母细胞瘤中,YAP可以通过促进调控高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB1）的上调并且促进其从细胞核到细胞质的易位来促进自噬。而YAP与自噬的关系在血管钙化中的研究较少,因此研究血管钙化中二者之间的关系具有重要的意义。综上所述,本实验从体内体外建立了血管钙化模型,探究YAP在血管钙化中的作用,并探究其在血管钙化中的作用机制,为CKD中血管钙化的治疗提供依据。研究目的（1）研究YAP在CKD大鼠血管钙化模型及VSMC钙化模型中的表达情况,研究YAP对血管钙盐沉积及VSMC成骨表型标志物转换的作用。（2）研究YAP对细胞自噬的调控作用:明确YAP是否通过自噬途径参与调控血管钙化。（3）研究YAP调控自噬的作用机制:明确YAP、Bc12与Beclinl之间是否存在直接作用。研究方法（1）建立CKD大鼠血管钙化模型:采用腺嘌呤灌胃8周的方式,建立CKD大鼠血管钙化模型。构建过表达YAP慢病毒载体,选取6周龄SD品系雄性大鼠,尾静脉注射过表达YAP慢病毒。两周后病毒表达,使用腺嘌呤灌胃8周。（2）动态检测心脏超声,测量左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。（3）实验末,测量体重,麻醉大鼠后心尖取血,并留取并分装胸主动脉及腹主动脉进行后续实验。（4）检测血管钙化情况及血管形态:Von kossa染色、茜素红S染色等检测血管钙盐沉积、Verh（?）eff弹力纤维染色观察血管弹力板结构。（5）检测血管组织中VSMC表型标志物转换:Western Blot检测成骨表型标志物Opn、RUNX2,收缩表型标志物Calponin的表达水平。（6）检测血管组织中VSMC自噬情况:通过WB检测自噬标志物ATG5、LC3蛋白表达水平。（7）建立VSMC钙化模型:选用A7r5平滑肌细胞系,3.25mmol/L的高磷（Pi）刺激VSMC6天,构建VSMC钙化模型。（8）过表达YAP腺病毒载体的构建:构建过表达YAP腺病毒载体,以空载体作为对照,转染VSMC,验证过表达YAP腺病毒的效果。（9）沉默YAP模型的建立:构建Si-YAP序列,以Si-NC作为对照,转染VSMC,验证Si-YAP沉默效果。（10）检测VSMC中YAP含量及亚细胞定位:通过Western Blot检测VSMC中YAP的含量及亚细胞定位。（11）检测VSMC钙化情况:通过钙离子检测、茜素红S染色等方法检测VSMC钙盐沉积情况。（12）检测VSMC表型转换:通过WB检测成骨表型标志物（BMP2、RUNX2）及收缩表型标志物（Calponin）的表达水平改变。（13）检测VSMC自噬情况:通过WB检测自噬标志物ATG5、LC3蛋白表达水平。通过免疫荧光检测LC3的表达水平。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）后检测VSMC的成骨表型标志物RUNX2的变化。（14）检测YAP、Bc12与Beclinl的结合以及Beclin1的泛素化水平:通过免疫共沉淀（Co-IP）的方法检测YAP、Bc12与Beclin1的结合以及Beclin1的泛素化水平。研究结果（1）体内实验:1)构建了 CKD大鼠血管钙化模型,CKD大鼠发生显著中膜钙化,血管中膜组织钙盐沉积及VSMC成骨表型标志物RUNX2、Opn的表达均上升。2)YAP在CKD大鼠血管中膜组织及心脏组织中表达下降。3)构建过表达YAP的慢病毒载体（LV-YAP）,LV-YAP致大鼠YAP的表达水平上升。4)过表达YAP抑制了 CKD大鼠血管中膜组织的钙盐沉积及VSMC成骨表型标志物RUNX2、Opn的表达,促进了收缩表型标志物Calponin的表达。5)CKD大鼠中VSMC凋亡标志物Cleaved-caspase3表达上升,过表达YAP显著降低了凋亡标志物Cleaved-caspase3表达。6)CKD大鼠中VSMC自噬标志物ATG5、LC3Ⅱ表达上升,过表达YAP进一步提高了自噬标志物LC3Ⅱ的表达。（2）体外实验:1)构建了 VSMC钙化模型,高磷刺激时VSMC成骨表型标志物RUNX2、BMP2表达上升,收缩表型标志物Calponin表达下降。2)构建过表达YAP的腺病毒载体（Ad-YAP）,Ad-YAP致VSMC中YAP的表达水平上升。3)过表达YAP抑制了 VSMC钙盐沉积及成骨表型标志物RUNX2、BMP2的表达,促进了收缩表型标志物Calponin的表达。4)构建了沉默YAP模型,沉默YAP促进了 VSMC钙盐沉积及成骨表型标志物BMP2的表达。5)高磷刺激后VSMC凋亡标志物Cleaved-caspase3、Bc12/Bax表达上升,过表达YAP显著降低了凋亡标志物Cleaved-caspase3、Bcl2/Bax的表达。6)高磷刺激后VSMC自噬标志物ATG5、LC3Ⅱ表达上升,过表达YAP进一步提高了自噬标志物ATG5、LC3Ⅱ的表达。7)使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）刺激过表达YAP的VSMC后,与过表达YAP组相比,成骨表型标志物RUNX2表达水平增加。8)高磷刺激VSMC后,Beclin1与YAP的结合增多,Beclin1与Bc12的结合减少,过表达YAP后Beclin1与Bc12的结合进一步减少。9)高磷刺激VSMC后,Beclin1的泛素化水平升高,过表达YAP后进一步提高了 Beclin1的泛素化水平。研究结论（1）YAP在CKD大鼠心脏和血管中膜组织及VSMC钙化模型中表达下调。（2）过表达YAP可以抑制CKD大鼠血管中膜组织及VSMC钙化。（3）YAP可以通过影响Beclin1的泛素化来影响Beclin1与Bc12的结合,进而影响自噬,最终影响血管钙化。