Mmc LPPA基因的克隆、表达及对小鼠免疫效力研究

来源 :西南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jeff006902000
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山羊传染性胸膜肺炎是山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病,该疾病感染不同年龄阶段的山羊,常引起胸腔的病变,临床主要特征是高热、咳嗽,渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症,肺有明显的肝变。山羊传染性胸膜肺炎具有很高的发病率和死亡率,对我国山羊养殖业的发展构成了日益严重的威胁。丝状支原体山羊亚种(Mmc)属于丝状支原体簇的一员,所含基因组庞大、基因组功能十分复杂。仅仅其中的脂蛋白基因就有LPPC、LPPB、LPPQ等,由于其结构域结构复杂、基因组序列中存在较多的终止密码子,各基因片段功能研究还不明确,相关研究进展比较缓慢。近些年来,研究者们对丝状支原体山羊亚种表面抗原蛋白进行了大量研究,发现具有膜定位功能的脂蛋白与丝状支原体山羊亚种标准株PG3刺激机体产生免疫反应以及产生致病力过程具有密切关系,这方面逐渐开始受到关注。脂蛋白A (LPPA)是一个共有蛋白,存在于整个丝状支原体簇。这些编码蛋白的基因以及基因家族具有高度的可变性。本文研究的对象是丝状支原体山羊亚种的膜表面抗原LPPA,其基因序列位于255号碱基到1822号碱基,是丝状支原体山羊亚种重要的抗原之一。根据GenBank上发表的PG3的LPPA基因序列并以此设计了一对引物,上游酶切位点是BamHⅠ;下游酶切位点则是HindⅢ。将本实验室分离保存的山羊支原体分离株进行菌株复苏与扩大培养,提取总DNA为模板,用PCR方法扩增该基因片段。将扩增得到的基因克隆到pMD18-T载体上,构建出pMD-18T/LPPA重组质粒,转化E.coli DH5α经蓝白斑和PCR鉴定筛选出阳性克隆并进行序列测定,应用BLAST和DNAStar软件对所测序列进行分析。利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切pMD-18T/LPPA重组质粒,然后将切下的目的片断插入到pET-32a-c(+)载体,构建出pET-32a-c(+)/LPPA重组质粒,重组质粒经PCR和酶切鉴定为阳性后,转化宿主菌E.coli BL21。利用IPTG诱导表达,并摸索最佳的诱导条件。通过SDS-PAGE电泳和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。利用亲和层析提纯蛋白。结果如下:1.用PCR方法成功克隆了1256bp大小的丝状支原体山羊亚种LPPA DNA片断,经BLAST分析,与GenBank已发表序列同源性为99.76%,共有3个位点发生突变,分别是:第67位碱基由A变T、136位碱基由C变T、676位碱基由T变A。氨基酸序列同源性为98.97%,共有2处存在差异,分别为:第20位的亮氨酸(L)变苯丙氨酸(F)、223位碱基由天门冬酰胺(N)变赖氨酸(K)。对蛋白的二级结构分析显示,碱性氨基酸(K,R)占14.78.%,酸性氨基酸(D,E)占14.59%,疏水性氨基酸(A,C,Q,S,T,Y)占27.83%,极性氨基酸占32.05%。α螺旋区域为1-8、87-89、114-126、202-208、345-354、373-378区段,共有的β折叠区域为9-25、152-156、309-313、327-332、369-371、448-451、501-503、514-519区段。该蛋白属于可溶性蛋白,LPPA表达蛋白大部分区域抗原性较好。2. SDS-PAGE电泳显示,原核表达产物的分子质量约为37KD,与预计大小相符。设定三个诱导条件,IPTG诱导浓度分别设为0.15mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L,当诱导浓度为0.3mmol/L时,诱导效果最佳;诱导时间分别为3h、6h、8h,当诱导时间为8h时,诱导效果最佳;诱导温度分别为25℃、30℃、37℃,当诱导温度为25℃时,诱导效果最佳。综上所述,最佳诱导条件为:0.3mmol/L IPTG,25℃,8h;经Western blotting试验进一步证实,该重组蛋白具有反应原性。3.用ELISA方法进行抗体检测,测得首免和二免14天后阴性对照组OD600为0.041。将待检血清OD600数值与其比较,求出P/N值。甲醛灭活苗和重组蛋白组首免后,4只小鼠有1只转阳,转阳率为25%;二免后全部转阳,其转阳率为100%;重组蛋白组首免后,4只小鼠没有转阳,转阳率为0%;二免后,有2只转阳,转阳率为50%。两个组在首免及二免后,抗体滴度均有上升。甲醛灭活苗和重组蛋白组的抗体滴度上升最为明显,约为两周时抗体滴度的5倍,重组蛋白组在首免和二免后,抗体滴度变化不大。通过重组蛋白对小鼠的免疫保护效力研究实验显示,重组蛋白能够诱导小鼠产生特异性抗体,对Mmc型菌的攻毒具有一定的免疫保护作用。
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