论文部分内容阅读
【研究背景】：真核生物基因3′非翻译区（3′untranslated region,3′UTR）是调控基因表达的重要功能元件，其影响mRNA的半衰期，细胞亚定位及翻译效率，此外3′UTR还可作为微小RNA（microRNA, miRNA）的作用靶点来沉默基因表达。脆性X综合征（Fragile X syndrome, FXS）是引起遗传性智力低下的常见疾病之一。大部分FXS是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1（fragile X mental retardation1, FMR1）5′非翻译区（CGG）n三核苷酸重复序列发生动态突变，继而导致相邻部位CpG岛异常甲基化引起其编码产物脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardationprotein, FMRP）的表达下降或缺失所致。近年有文献报道FXS前突变患者中发现FMR1基因3′UTR有点突变存在，提示FMR1基因3′UTR的异常可能参与FXS发病。MiRNAs是一类长度约为19~23个核苷酸非编码单链小分子RNA，能与mRNA的3′UTR结合，发挥转录后基因沉默功能。本研究小组在前期实验中证实有部分miRNAs能与FMR1基因3′UTR结合下调报告基因的表达。因此，我们推测FXS患者FMR1基因3′UTR的点突变可能与miRNA的作用有关，FXS致病基因FMR1的3′UTR是否与发病相关则尚未见详细报道。【研究目的】本研究采并对FMR13′UTR的结构进行信息学分析，用生物信息学分析与体外试验相结合的方式验证FMR13′UTR突变对FMR1基因表达的影响，及其与miRNA的关系，对于阐明FXS发病机理具有探索性意义。【方法】：结合文献报道的FMR1基因3′UTR突变位点分布，的采用生物信息学软件分析hFMR1基因3′UTR的结构以及潜在的miRNA作用靶点。然后构建真核报告基因表达质粒，即以hFMR13′UTR（wild-type construct, WT）或其突变(mutation constructs,MUT)作为转录终止区的萤火虫荧光素酶报告基因。瞬时转染非神经源性HEK-293细胞及神经源性SH-SY5Y细胞，采用双荧光素酶突变前后荧光素酶活性变化。对有活性改变的突变点，转染表达载体后提取细胞RNA，用荧光定量PCR检测报告基因转录本的含量；提取细胞浆蛋白并合成RNA探针，作电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，观察WT及MUT两种探针与浆蛋白的结合差别；把野生及突变型3′UTR与候选miRNA共转染，观察miRNA对两种3′UTR活性的影响。【结果】：1.746T>C点突变位于hFMR13′UTR保守区。通过生物学软件分析，共发现hFMR13′UTR上存在3个保守区，文献报道的四个突变位点均位于保守区，突变点附近有miRNA调控靶点。2. hFMR13′UTR746T>C点突变在转录后水平下调报告基因的表达。将hFMR13′UTR上突变前后的质粒分别转染HEK293细胞和SY5Y细胞。与WT质粒相比，746T>C突变型质粒的荧光素酶活性下降50%(P<0.01)，其余个突变型质粒的荧光素酶活性无显著性差异(P>0.05)。荧光定量PCR结果显示，在HEK293细胞和SY5Y细胞中，与WT质粒相比，746T>C突变型质粒转录的mRNA均升高，差异有统计学意义。3.746T>C点突变下调报告基因的作用可能3′UTR结合蛋白及miRNA有关。通过电泳迁移率实验，本研究发现WT和746T>C片段均能与细胞浆蛋白特异性结合，且有细胞种属特异性。野生型片段与突变型片段在同种细胞内能与不同的浆蛋白结合。通过miRNA共转染，发现miRNA能对两型3′UTR的报告基因表达有不同的下调作用，且这种作用具有细胞种属差异性。【结论】：hFMR13′UTR T>C点突变在转录后水平影响报告基因转录，该突变点位于保守区，其作用与胞浆3′UTR结合蛋白及miRNA有关。