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人类免疫缺陷病毒(HIV)能直接感染患者的神经系统,引起患者神经系统功能障碍(HIV/neuroAIDS),HIV 导致的神经病理性疼痛(HIV induced neuropathic pain,简称 HNP)是HIV/neuroAIDS最常见的并发症之一。前期研究发现在辣椒素诱导的小鼠疼痛模型中脊髓脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotophic factor,BDNF)参与了疼痛信号的转导,gp120可激活小胶质细胞BV2中Wnt/β-catenin信号通路并导致BDNF表达上调,而gp120是HIV主要毒性蛋白,可诱发HNP。在此基础上,本课题拟在体内进一步开展脊髓Wnt/β-catenin信号通路调控BDNF参与HNP的作用研究。通过鞘内注射(i.t.)gp120建立小鼠HNP模型:在鞘内注射gp120后不同时间(0、1、2、4、6h)用Von Frey法和热板检测小鼠的机械缩足反应阈值与热缩足反应时间阈值。结果显示:与对照组相比,鞘内注射gp120 1h后,小鼠机械缩足反应阈值和热缩足反应时间阈值显著降低,在2h后到达低谷,且疼痛至少可维持6h,这表明HNP动物模型造模成功。为了确认BDNF与HNP的关系,在建立疼痛模型后,用免疫蛋白印记(Westem blotting,WB)和免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测小鼠脊髓内BDNF的表达变化。WB分析的结果表明:与Oh相比,鞘内注射gp120后1、2、4h,小鼠脊髓内BDNF的蛋白表达量明显上调。其中,在2 h,BDNF的蛋白表达量达到峰值,约为对照组的1.7倍。而IF结果也表明在鞘内注射gp120 2h后小鼠脊髓内BDNF表达量显著上调。这表明BDNF在HNP病变中发挥重要作用。为进一步确定BDNF与HNP直接的联系,通过鞘内注射BDNF的阻断剂TrkB-Fc阻断BDNF信号后对小鼠进行机械痛觉过敏试验:鞘内注射TrkB-Fc 30min后施用gp120。结果显示:与施用PBS+gp120组相比,TrkB-Fc+gp120组在给药1h时就能显著抑制gp120诱导的机械痛觉过敏,且在2h时抑制效果最显著,小鼠疼痛阈值约为HNP小鼠的4.8倍。这进一步表明,BDNF参与gp120诱导的HNP发生。与此同时,还发现HNP小鼠脊髓Wnt3a、β-catenin的表达量也显著上调,其趋势与BDNF变化相似。而且,鞘内注射Wnt3a激活Wnt/p-catenin信号通路2h后小鼠脊髓内β-catenin和BDNF蛋白表达量相对于对照组都显著增加,分别是对照组的1.7倍和2.2倍,与鞘内注射gp120后引起的脊髓内β-catenin和BDNF蛋白上调水平相当。同时发现鞘内注射Wnt3a和gp120都诱导了小鼠的机械痛觉过敏,且行为学变化趋势一致。这一实验结果初步说明gp120可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控BDNF表达从而诱发小鼠神经病理性疼痛。为了进一步研究Wnt/β-catenin信号通路是否参与脊髓BDNF的表达并影响机械异常性疼痛,我们使用了 2种不同机制阻断Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂IWR-1和DKK1来阻断该通路,检测阻断Wnt/β-catenin信号通路后HNP小鼠脊髓中BDNF等相关蛋白的表达变化及对HNP小鼠机械痛的影响。结果显示,与单独施用gp120组小鼠比,鞘内注射IWR-1和DKK1的HNP小鼠脊髓内β-catenin和BDNF均显著下调,同时发现:在给药后2h时,施用IWR-1阻断剂的HNP小鼠疼痛阈值约为HNP小鼠的3倍;而施用DKK1阻断剂的HNP小鼠疼痛阈值约为HNP小鼠的3.2倍。这表明阻断Wnt/β-catenin信号通路可以抑制BDNF的表达同时能够减轻gp120诱导的机械痛。综上所述:脊髓Wnt/p-catenin信号通路通过调控BDNF参与gp120诱导的HNP。本课题为研究HNP病理机制提供实验依据,对于开发具有靶向性的新型治疗药物以缓解HNP具有重要意义。