第一部分铜绿假单胞菌药物敏感性试验及流行病学分析[目的]了解同济医院临床分离的铜绿假单胞菌基因型及耐药情况,为抗生素的合理使用及感染控制提供科学依据。[方法]收集同济医院2012年6月-2012年8月从临床感染患者标本中分离鉴定得到的60株铜绿假单胞菌,采用Kirby-bauer法对60株铜绿假单胞菌的耐性情况进行分析；用多位点序列分型技术(Multillocus sequence typing, MLST),以铜绿假单胞菌7个管家基因acsA、aroE、guaA mutL、nuoD、ppsA和trpE的内部特定核酸片段作为检测的靶基因,对60株铜绿假单胞菌的靶基因进行PCR扩增和测序,测序结果在Pseudomonas aeruginosa MLST数据库中进行比对,最终确定这60株铜绿假单胞菌的基因型：通过eBURST方法对这60株铜绿假单胞菌进行进化聚类分析,同时通过SplitsTree软件进行菌株基因遗传进化分析。并使用SPSS统计软件分析差异显著性。[结果]60株铜绿假单胞菌对多种抗菌药物耐药率均较高,耐药率由高到低依次是：米诺环素(MH)(100.0%)、哌拉西林(PIP)(55.0%)、左氧氟沙星(LEV)(51.6%)、亚胺培南(PM)(48.3%)、庆大霉素(GN)(48.3%)、头孢哌酮(CFP)(48.3%)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)(46.6%)、美洛培南(MEM)(46.6%)、环丙沙星(CIP))(45.0%)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)(45.0%)、头孢吡肟(FEP)(43.3%)、氨曲南(ATM)(43.3%)、阿米卡星(AK)(38.3%)和头孢他啶(CAZ)(15.0%)。其中9株对所测试的14种抗生素全部耐药。MLST分析显示60株铜绿假单胞菌可分为11个ST型,即ST262、ST195、ST767、ST274、ST527、ST849、 ST639、ST871、ST244、ST636和ST645型,未发现新的型别；其中ST244和ST274是优势ST型别,分别占26.67%(16/60),18.33%(11/60)；且ST244型在ICU及呼内科数量显著高于其它科室(p<0.05)。ST244、ST274型在碳青霉烯类药物不敏感组中所占比例要显著高于在碳青霉烯类药物敏感组中所占比例(p<0.05),其它ST型与药物敏感性试验无相关性(p>0.05)。[结论]60株铜绿假单胞菌耐药性较为严重,并出现9株全耐株。本地区以ST244和ST274为优势克隆株,尤其在ICU及呼内科数量显著高于其它科室,提示医院内存在小范围的传播。ST244和ST274型与耐药性的关系尚不能确定,需作进一步研究。第二部分铜绿假单胞菌对其它微生物的抑制作用观察[目的]观察临床分离的铜绿假单胞菌对微生物的抑制作用,为抗感染治疗药物研发提供线索。[方法]采用纸片法观察临床分离铜绿假单胞菌对金黄色葡萄球菌ATCC25923及对白色念珠菌ATCC90028的抑制作用,在抑菌作用最强和无抑菌作用的铜绿假单胞菌中各选择2株菌(PA126、PA1246和PA1201、PA1222)用于进一步研究。通过纸片法、十字征划痕实验和共孵育实验检测这4株铜绿假单胞菌对革兰阳性球菌(包括MRSA,VISA及MRSA)、革兰阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性球菌及真菌的抑制作用；观察温度、pH值、孵育时间、碳源及氮源对铜绿假单胞菌抑菌作用的影响。建立小鼠共感染模型观察铜绿假单胞菌对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌的体内抑制作用。[结果]PA1206和PA1246对革兰阳性球菌(包括MRSA,VISA及MRSA)、革兰阳性杆菌、革兰阴性双球菌、真菌具有显著抑制作用,抑制率为100%,对革兰阴性杆菌则无抑制作用,PA1201和PA1222对上述指示菌均无作用。在影响因素中,铜绿假单胞菌孵育后24小时后培养物在4℃到121℃之间时显示对金黄色葡萄球菌ATCC25923抑制作用没有明显改变。pH值为7时抑制作用最强,而pH=4,pH=10时,抑制作用丧失。在麦芽糖(maltose)和可溶性淀粉(starch soluble)作碳源时,抑制作用相对减弱,使用其它碳源时抑制作用较强。在使用氮源时,L-天冬酰胺(asparaginate),磷酸铵(ammonium phosphate)能完全抑制铜绿假单胞菌的活性成分的产生,使它对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制作用完全丧失。硝酸胺(ammonium nitrate),硝酸钠(sodium nitrate)则能部分的抑制铜绿假单胞菌对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制作用。硝酸钾(Potassium nitrate),硫酸铵(ammonium sulfate),氯化铵(ammonium chloride)作为氮源时铜绿假单胞菌的抑菌作用最强。孵育时间显示,第1天到第12天杀灭作用逐渐增强,第12天至第15天抑制作用逐渐减弱。铜绿假单胞菌与白色念珠菌(或金黄色葡萄球菌)共感染模型显示,在小鼠体内对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌也具有抑制作用。[结论]铜绿假单胞菌对革兰阳性球菌,革兰阳性杆菌,革兰阴性球菌及真菌有杀灭或抑制作用,而对革兰阴性杆菌则几乎没有作用。pH值、碳源及氮源、孵育时间的改变可影响其抑制作用。铜绿假单胞菌在体内对其它微生物也具有抑制作用。对临床上比较棘手的MRSA、VISA、MRSCN及真菌感染可能提供新的治疗途径。第三部分铜绿假单胞菌对微生物抑制作用机制研究[目的]探讨铜绿假单胞菌对其它微生物抑制作用的机制,以期发现针对微生物感染的治疗方法。[方法]脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析这四株铜绿假单胞菌的同源性。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析这4株菌在分泌蛋白上的差异。通过对4株菌的培养物进行氯仿粗提后,运用薄层液相色谱(TLC),放射自显影分析其活性成分组分,分析型高效液相色谱对粗提物进行分析,硅胶柱对粗提物进行初步分纯,再通过制备型高效液相对初步分纯物各主峰洗脱液进行收集纯化,得到有效主峰洗脱液成分,纯化后进行抑菌实验,并通过质谱分析其分子量大小。[结果]PFGE显示这四株菌来源各不相同。SDS-PAGE显示有抑制作用的PA1206和PA1246在分泌蛋白上与无抑制作用的PA1201和PA1222存在明显差异。氯仿粗提物显示,PA1201和PA1222颜色呈绿色,PA1206和PA1246呈深棕色。铜绿假单胞菌PA1206和PA1246粗提物显示有抑制作用,而PA1201和PA1222粗提物则没有作用。粗提物经硅胶柱层析分离初步纯化及制备型高效液相进一步分离纯化后,采用质谱分析确认PA1206和PA1246主要活性成分为4种小分子类物质。这可能是与PA1201和PA1222产生不同作用的主要机制。[结论]有抑制和杀灭作用的铜绿假单胞菌是通过产生特异分泌性蛋白,或小分子物质来抑制其它微生物,没有作用的铜绿假单胞菌则不产生这些小分子物质或蛋白。此二株有很强活性的菌株代谢产物有可能被制成杀菌剂应用到临床,对临床上比较棘手的MRSA和VISA或其它真菌感染可能有很好的应用价值。此作用可能与铜绿假单胞菌分泌小分子类物质或相关蛋白作用于细菌细胞壁有关。