肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤,也是全球癌症死亡的首要原因,严重威胁人类健康。在美国,肺癌在男性和女性的恶性肿瘤中的病死率均居第一位。2009年约有219440例肺癌新发病例,并有159390例肺癌患者死亡。在发展中国家,特别是中国,肺癌的发生率一直呈上升趋势。如果不积极控制吸烟和空气污染,到2025年我国每年肺癌患者将超过100万,成为世界第一肺癌大国。非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)占全部肺癌约85%。尽管诊断方法及治疗手段的不断更新,NSCLC的治疗在过去的几十年并未取得突破性的进展,即使I期的NSCLC患者,其5年生存率也只有50%,II期患者,5年生存率只有30%,晚期患者,5年生存率仍然不到15%,肿瘤侵袭以及转移是肺癌患者死亡的主要原因。随着分子生物学技术的发展,分子标志物在NSCLC的辅助诊断、判断预后以及评估疗效中发挥着日益重要的作用。因此,大量的实验研究都在寻求敏感性和特异性都较高的分子标记物,可以早期诊断肺癌,评估疗效和判断预后。黑色素瘤相关抗原E-A3(melanoma-associated antigen-A3, MAGE-A3)是一种肿瘤-睾丸抗原,首先发现于黑素瘤细胞。它作为人类已经发现并鉴定的肿瘤特异性抗原,广泛表达于人体的多种肿瘤组织及细胞,如黑色素瘤、头颈部鳞癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等,而在正常组织中(除睾丸和胎盘外)不表达。有研究显示,30%～50%的NSCLC患者表达MAGE-A3,表明MAGE-A3在人类肿瘤形成、发展和转移的病理过程中可能起着非常重要的作用。研究目的：1.研究MAGE-A3在肺癌患者外周血中的表达规律,并分析其与肺癌临床病理特征的关系,初步探讨MAGE-A3在肺癌中的辅助诊断价值。2.判断MAGE-A3在肺癌疗效评估和预后判断中的价值。3.构建重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP,并检测其在人肺癌细胞系A549的表达情况。材料与方法：1.研究对象(分为两部分)：第一部分：肺癌患者,分三组第二部分：非小细胞肺癌细胞株A549肺癌组：共120例,选自2009年6月到2011年9月于南京军区南京总医院住院的患者,均为肺癌患者,未经治疗并计划接受至少1周期标准一线含铂的两药联合的化疗。入组的标准：(1)经细胞学或组织学证实为肺癌；(2)按照2009年国际肺癌研究协学会(International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)公布修订的UICC7th分期标准进行分期,I-IV期NSCLC患者以及小细胞肺癌患者；(3)按ECOG PS评分为0-2分；(4)肝肾功能及血常规无明显异常,无其他并发病或并存病。肺良性病变组：共39例,为同期连续选取南京军区南京总医院住院患者。所有病例均经临床、影像学或病理学诊断为肺良性病变,其中肺炎25例,肺结核1例,发热菌血症1例,肺不张2例,间质性肺炎1例,慢性阻塞性肺疾病6例,支气管扩张伴感染3例。正常对照组：共32例,来自于南京军区南京总医院健康体检者,均无心、肝、肺和肾等重要器官疾病,肝肾功能,血常规以及其他辅助检查均无明显异常者。2.实验方法(1)外周血标本的采集：抽取健康志愿者及肺良性病变患者空腹外周静脉血5m1,肺癌患者在第1及第3个周期化疗前分别抽取空腹外周静脉血5ml。所有血样抽取后30min内进行离心(室温,2000RPM,10min),吸出上清,留取下层血细胞沉淀,储存于-80℃深低温冰箱备用。采用TRIzol法提取外周血标本的总RNA,用酶标仪检测所提取总RNA浓度及质量,检测合格者采用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法反转录成cDNA,试剂盒均购自Formentas Life Sciences公司(美国)。采用实时聚合酶链式反应(real time PCR)方法的荧光染料法(SYBR Green)检测外周血中MAGE-A3的表达水平,选用Takara公司提供的SYBR Green试剂,上述实验严格按照试剂盒的使用说明书进行操作。(2)利用DNA重组技术将黑色素瘤相关抗原-A3(MAGE-A3)基因克隆到带GFP的慢病毒表达载体质粒PLV中,经限制性酶切和测序鉴定真核重组载体。将重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP与包装质粒pCMV-dR8.91及pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293TAB,包装重组慢病毒LV-MAGE-A3-GFP,并感染人肺癌细胞株A549,观察绿色荧光状态,并采用Western blot法检测MAGE-A3蛋白的表达情况。3.客观疗效评价标准所有肺癌患者于第1及3周期化疗前行全身检查,按照RECIST1.1实体瘤疗效评价标准,化疗疗效评估分为：完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、病灶稳定(stable disease, SD)和病灶进展(progressive disease, PD)。 CR:所有靶病灶消失；所有病理性淋巴结短径<10mm;且肿瘤标志物降至正常；PR：评价5个靶病灶(每个器官≦2个病灶),以最初的靶病灶直径总和作为参照,其长径总和缩小至少30%；PD：以化疗过程中靶病灶直径的总和最小值为参照,靶病灶长径总和增加20%以上,并且其绝对值增加超过5mm。除此之外,出现新病变也视为PD; SD:靶病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD。 CR和PR定义为有效,SD和PD定义为无效。4.随访以总生存期(Overall survival, OS)作为随访终点,OS定义为是指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。7例患者失访。5.统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析。定量资料描述采用例数、中位数、四分位间距。组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。治疗前后组间比较采用Wilcoxon符号秩检验。定性资料描述采用例数和百分比(%)。组间比较采用Chi-square检验。等级资料采用Kruskal-Wallis H检验。MAGE-A3区分疾病良恶性的性能分析采用ROC曲线法,计算曲线下面积及其95%可信区间。采用Kaplan-Meier法描述MAGE-A3不同基线水平时肺癌患者的生存情况,两组生存情况的比较用log-rank检验。采用Cox回归模型分析肺癌患者生存时间的影响因素,计算相关因素的危险比(hazards rate,HR)。 P≤0.05表示差异有统计学意义。结果：1.肺癌组、肺良性病变组、正常对照组患者的外周血MAGE-A3基因的表达量中位值分别为0.156,0.010,0.001。肺癌患者外周血MAGE-A3的表达水平高于肺良性病变组和正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。肺良性病变患者的外周血MAGE-A3的表达水平高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。2.通过建立ROC曲线确定外周血基线MAGE-A3基因水平区分良恶性的最佳截取值(cut-oflF)。 MAGE-A3的曲线下面积(area under the ROC curve, AUC)为0.860(95%CI:0.809-0.911)。 Cut-off值为0.115时敏感度(53.3%)和特异度(100%)最高。3.将120例肺癌组内的研究对象按性别、年龄(<60岁和≧60岁)、分期、分化程度(中高分化和低分化)、病理类型(腺癌、鳞癌和小细胞癌)、有无淋巴结转移、原发病灶部位(左肺和右肺)、有无远处转移、有无吸烟史分成两组,然后进行比较,外周血MAGE-A3的表达水平在年龄、组织学类型、分化程度、淋巴结转移及原发病灶部位等方面无明显差异。伴有远处转移的患者外周血中的MAGE-A3的中位表达水平高于无远处转移的患者(0.407,0.024),差异有统计学意义(P<0.001)。Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者MAGE-A3的中位表达水平(0.238,0.003)高于I-II期的NSCLC患者,差异有统计学意义(P=0.005)。表明MAGE-A3在肺癌的表达可能与细胞增殖及远处转移相关。此外,既往有吸烟史的肺癌患者MAGE-A3的中位表达水平低于无吸烟史的肺癌患者(0.062,0.528),差异有统计学意义(P<0.001)。男性肺癌患者MAGE-A3的中位表达水平低于女性肺癌患者(0.062,0.559；P<0.001)。4.120例肺癌患者中,收集了61例患者第1周期和第3周期化疗前的外周血,动态观察治疗的过程中MAGE-A3水平的变化情况。化疗后,外周血MAGE-A3水平较化疗前显著下降,差异有统计学意义(P<0.001)。绘制ROC曲线,确定MAGE-A3下降率的最佳cut-off值,从而通过化疗前后MAGE-A3的变化情况来预测化疗疗效。根据ROC曲线分析,AUC为0.700(95%CI:0.551-0.850),MAGE-A3下降率预测化疗疗效的最佳截取值为92.9%,此时敏感度和特异度都达到最高,分别是45.5%,97.4%,化疗后MAGE-A3下降率≥92.9%定义为MAGE-A3应答。MAGE-A3应答与无MAGE-A3应答的患者化疗疗效之间存在统计学差异(P<0.001)。5.120例肺癌患者,整体OS中位时间为10.630个月。绘制生存曲线,外周血MAGE-A3低表达的患者(MAGE-A3<0.115)OS时间(中位OS时间为20.930个月)长于高表达的患者(MAGE-A3≥0.115)(中位OS时间为6.500个月),差异有统计学意义(P<0.001)。6.通过双酶切重组MAGE-A3和PLV GFP慢病毒质粒载体可以构建出重组真核慢病毒表达质粒PLV-MAGE-A3GFP通过观察绿色荧光状态,并采用Western blot法检测MAGE-A3蛋白的表达情况,证实重组慢病毒载体质粒PLV-MAGE-A3-GFP与包装质粒pCMV-dR8.91及pCMV-VSV-G包装的重组慢病毒LV-MAGE-A3-GFP,可成功感染人肺癌细胞株A549。结论：1.MAGE-A3在肺癌患者外周血中的表达水平较肺部良性疾病组和健康对照组高,这表明MAGE-A3的异常表达与肺癌的发生有关。2.MAGE-A3在肺癌患者外周血中的异常表达与肿瘤的分期、远处转移相关,表明MAGE-A3在肺癌的增殖以及侵袭性中可能起着非常重要的作用。3.外周血中MAGE-A3的表达水平对肺癌的诊断有一定的辅助价值。4. MAGE-A3可以作为监测肺癌患者化疗疗效、判断预后的指标。5.通过DNA重组技术重组MAGE-A3和PLV-GFP慢病毒质粒载体可以构建出重组真核慢病毒表达质粒PLV-MAGE-A3-GFP。并通过与包装重组慢病毒成功感染人肺癌细胞株A549。总结本实验采用Real time PCR技术检测肺癌患者、肺良性病变及正常对照者的外周血中MAGE-A3的表达水平,研究MAGE-A3的表达与肺癌发生、转移的关系,探讨MAGE-A3在肺癌中的诊断、疗效评价以及判断预后中的价值。此外,利用DNA重组技术将MAGE-A3基因克隆到带GFP的慢病毒表达载体质粒PLV中,体外构建重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP,成功感染人肺癌细胞株A549,并使MAGE-A3基因得以稳定表达,为进一步对非小细胞肺癌(NSCLC)进行免疫治疗提供了实验依据。MAGE-A3是一种肿瘤特异性相关抗原,广泛表达于多种肿瘤组织,具有多种生物学功能,在肺癌患者的外周血中高表达,可能与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。此外,MAGE-A3可以作为肺癌预测疗效和判断预后的指标。深入研究MAGE-A3在肺癌中的表达、功能以及调控,有助于进一步认肺癌发生发展与转移的分子特点,可能为其提供新的治疗靶点。