睾丸特异性蛋白酶50(Testes-specific protease 50,TSP50)是在人乳腺癌组织中发现的一种原癌基因,具有苏氨酸蛋白酶活性。TSP50在睾丸以外的正常组织中均不表达或低表达,但在多种人类肿瘤组织中却异常高表达。进一步的研究显示,TSP50可促进细胞增殖、侵袭和转移,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。本课题组的前期研究发现,TSP50可通过激活NF-κB信号通路促进肿瘤的发生、发展和转移,同时也发现TSP50可以抑制激活素信号应答性荧光素酶报告蛋白(CAGA-luc)的活性。激活素(Activin)属于TGF-β超家族的成员之一,具有多种生物学功能,可抑制细胞增殖,那么TSP50是否是通过抑制激活素信号而促进肿瘤的发生呢?为了阐明TSP50抑制激活素信号通路的具体机制以及其与TSP50促肿瘤发生之间的相关性,本文进行了以下研究。1.TSP50对细胞内激活素信号的影响激活素信号是通过以下途径来传递的:激活素与激活素受体II(Activin receptor type II,ActRII)在膜上结合,并使其磷酸化,磷酸化的ActRII进一步招募并磷酸化激活素受体I(Activin receptor type I,ActRI),磷酸化的ActRI再磷酸化Smad2/3,之后磷酸化的Smad2/3(Phosphorylated-Smad2/3,p-Smad2/3)进入细胞核,与靶基因的启动子结合,进而调控下游靶基因的表达。为了进一步确认我们前期的研究结果,我们首先通过过表达和Knock-down方法检测了TSP50对激活素信号的影响。(1)过表达TSP50对正常细胞内Smad2/3入核的影响为了研究TSP50对激活素信号是否具有抑制作用,我们在正常细胞内过表达TSP50,然后通过western blot方法检测了细胞内激活素信号下游的转录因子Smad2/3的入核情况。结果显示,过表达TSP50可以抑制人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和人正常肝细胞(L02)核内的Smad2/3水平,而且用激活素A刺激后效果更加明显。此结果表明,过表达TSP50可以抑制正常细胞内Smad2/3的入核。(2)敲低TSP50的表达对肿瘤细胞内Smad2/3入核的影响为了进一步证实上述结果,我们通过RNA干涉方法敲低了内源性高表达TSP50的肝癌细胞HepG2和3种乳腺癌细胞ER7530、BT474和MDA-MB-231中的内源TSP50,并通过western blot方法检测了细胞核内Smad2/3的水平。结果显示,与对照组相比,敲低TSP50的表达后细胞核内Smad2/3的水平明显提高。这些结果表明,TSP50可抑制细胞内的激活素信号。(3)TSP50的蛋白酶活性对Smad2/3入核的影响TSP50是一种新型的苏氨酸蛋白酶,其蛋白酶活性对TSP50诱导的细胞增殖、侵袭、转移,以及肿瘤发生至关重要。TSP50的蛋白酶活性取决于其催化三联体结构,而催化三联体中的Thr310则对TSP50的酶活性起着关键作用。为了研究TSP50的蛋白酶活性在TSP50抑制激活素信号中是否也发挥着重要作用,我们将TSP50的第310位的Thr突变为Ala,使其蛋白酶活性丧失。将突变体TSP50 T310A的真核表达载体转染入HEK293T细胞,之后通过western blot方法检测过表达突变的TSP50对激活素信号的影响。结果显示,突变体TSP50 T310A对细胞内p-Smad2/3的水平和Smad2/3的入核没有明显的抑制作用。此结果表明,TSP50的苏氨酸蛋白酶活性在其抑制激活素信号中同样发挥着关键作用。2.TSP50抑制激活素信号的机制研究(1)TSP50与激活素信号分子的相互作用分析在前面的研究中我们已经证实,TSP50能够抑制激活素信号,此结果提示,TSP50可能直接或间接地与激活素信号分子相互作用,从而抑制激活素信号的转导。鉴于TSP50是膜蛋白,所以我们考虑TSP50可能与激活素信号中的膜受体相互作用。为了确定TSP50与哪种受体结合,我们在HEK293T细胞中共转染了TSP50和myc-ActRIIA或myc-ActRIB的真核表达载体,之后通过免疫共沉淀方法检测了TSP50与激活素的两个跨膜受体之间的相互作用。结果显示,TSP50可以和ActRIIA相互结合,但是不能和ActRIB结合。为了进一步阐明TSP50与ActRIIA的结合部位,我们将TSP50分别与ActRIIA的胞外段和胞内段进行了共表达,并通过哺乳动物双杂交体系检测了TSP50与ActRIIA的相互作用。结果表明,TSP50可与ActRIIA的胞外区直接结合。(2)TSP50对激活素受体磷酸化的影响ActRII和ActRI的磷酸化对激活素信号的传递起着至关重要的作用,鉴于TSP50可与ActRIIA结合,我们考虑是否TSP50影响了ActRIIA的磷酸化,进而抑制了激活素的信号。为了验证我们的假设,我们在HEK293T细胞中共转染了TSP50、myc-ActRIIA和myc-ActRIB的真核表达载体,提取蛋白后用myc-tag抗体进行免疫沉淀,并用p-Ser/Thr抗体检测myc-ActRIIA和myc-ActRIB的磷酸化水平。结果显示,TSP50对ActRIIA和ActRIB的磷酸化都有明显的抑制作用。结合前面的结果,我们推测TSP50通过与ActRIIA结合,抑制了ActRIIA的磷酸化,并进而抑制了ActRIB的磷酸化。3.激活素信号在TSP50诱导的细胞增殖中的作用研究(1)ActRIB组成性激活突变体的制备及鉴定由前面的研究我们得知,TSP50可通过抑制Act RII的磷酸化,进而抑制Act RI的磷酸化,从而抑制激活素的信号,那么TSP50对激活素信号的抑制作用与其促肿瘤发生作用之间是否存在相关性呢?为阐明此问题,我们构建了ActRIB的组成性激活突变体(Act RIBT206D),并对其活性进行了鉴定。将TSP50和ActRIBT206D的真核表达载体共转染入人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中,之后通过western blot方法检测过表达ActRIBT206D对TSP50抑制的激活素信号的拯救作用。结果发现,ActRIBT206D可以明显逆转TSP50引起的Smad2/3入核减少。此结果说明,我们成功构建了ActRIB的组成性激活突变体,可用于后续的研究。(2)激活激活素信号对TSP50诱导的细胞增殖的影响为了检测TSP50对激活素信号的抑制作用与TSP50促细胞增殖作用之间的相关性,我们在人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中过表达了TSP50和ActRIBT206D,并分别通过MTT法、BrdU掺入实验和Ki67染色方法检测了MCF-10A细胞的增殖情况。结果显示,过表达TSP50可明显增强细胞的活力、促进细胞中DNA的合成以及增殖相关抗原Ki67的表达,而同时过表达ActRIBT206D则能够逆转TSP50引起的细胞增殖。以上结果说明,TSP50的促细胞增殖作用与其抑制激活素信号密切相关。(3)激活激活素信号对TSP50诱导的肿瘤发生的影响已有研究表明,TSP50能明显增强细胞的克隆形成能力及其在裸鼠体内的成瘤能力。那么通过过表达ActRIBT206D而增强激活素信号,是否会逆转TSP50的促肿瘤发生作用?为此,我们在乳腺上皮细胞MCF-10A中过表达了TSP50和ActRIBT206D,并进一步通过软琼脂克隆实验和裸鼠成瘤实验检测了ActRIBT206D对TSP50促肿瘤发生作用的影响。结果显示,ActRIBT206D能够逆转TSP50引起的克隆形成和肿瘤发生。这些结果说明,激活素信号在TSP50诱导的肿瘤发生中是必需的,TSP50促进肿瘤发生的作用至少有一部分是通过抑制激活素信号通路来实现的。4.TSP50通过抑制激活素信号诱导细胞增殖的分子机制研究激活素信号的下游靶基因p21和p27是重要的细胞周期抑制因子,对细胞增殖起着关键作用。为了探讨TSP50通过抑制激活素信号促进细胞增殖的具体机制,我们探讨了激活素信号的下游靶基因与TSP50促进细胞增殖的关系。我们分别在MCF-10A和L02细胞中过表达了ActRIBT206D和TSP50,并通过western blot方法检测了细胞内激活素信号下游的靶基因p21和p27的表达情况。结果表明,过表达TSP50能明显降低MCF-10A细胞和L02细胞内p27的表达,但是对p21表达的影响则很小。而过表达ActRIBT206D则能够明显逆转MCF-10A和L02细胞中TSP50引起的p27表达减少。另外,当通过RNAi方法敲低乳腺癌细胞ER7530中内源表达的TSP50后,p27的表达水平则明显升高。综合以上结果提示,TSP50通过与ActRIIA结合抑制激活素信号,进而抑制其下游靶基因p27的表达,从而促进细胞的增殖和肿瘤发生。5.TSP50、p-Smad2/3及p27在乳腺癌组织中的表达情况及其与乳腺癌患者临床指标之间的相关性研究前面,我们已经在体外实验和小鼠体内实验中证实了激活素信号在TSP50调控的细胞增殖中发挥着重要作用,那么,在肿瘤患者体内TSP50与激活素信号之间是否存在相关性,并且这种相关性与肿瘤的其他临床指标之间关系如何?为了阐明这些问题,我们收集了71例乳腺癌组织标本,利用免疫组化检测了这些组织中TSP50、p-Smad2/3和p27的表达情况。结果显示,在乳腺癌组织中,TSP50的表达水平与p-Smad2/3和p27的水平呈明显的负相关,尤其是在10例TSP50高表达的组织样本中,分别有8例和6例不表达p-Smad2/3和p27。而且,这种负相关性与肿瘤分级和预后指标(ER、PR和HER-2)的表达水平存在明显相关性。我们的研究结果显示,与低表达TSP50且高表达p-Smad2/3或p27的乳腺癌患者相比,高表达TSP50且低表达p-Smad2/3或者p27的患者,肿瘤分级普遍较高,而且更容易表现出ER、PR阳性和HER-2阴性。本研究系统地探讨了TSP50抑制激活素信号的分子机制及其与TSP50促肿瘤发生作用之间的相关性,发现TSP50可通过与ActRIIA结合并抑制其磷酸化,进而抑制ActRIB及Smad2/3的磷酸化以及Smad2/3的入核,最终抑制激活素信号下游靶基因p27的表达,从而影响细胞周期,促进细胞增殖和肿瘤发生。而且TSP50与激活素信号分子表达水平间的负相关性与乳腺癌的其他临床指标之间具有一定的相关性。本研究为阐明肿瘤的发生机制奠定了重要的理论基础,同时也为乳腺癌的诊断、预后评估和治疗提供了新的视角。