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人乳一直被认为是婴儿最佳的食物来源,也是婴儿配方粉的黄金标准。其中,人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分,在促进婴儿肠道菌群生长、完善免疫系统功能和抵抗病原体侵染过程中发挥着不可替代的作用。然而,HMOs结构复杂,异构体众多且含量差异大,这些都对人乳结构与功能关系的研究造成了巨大的困难。因此,开发人乳寡糖合适的分离、纯化和结构表征方法尤为重要。婴儿配方粉一般以成熟的牛乳为原料,缺少人乳中普遍存在的绝大部分HMOs,只含有极低含量的唾液酸化寡糖,如3′-唾液酸乳糖(3′-Sialyllactose,3′-SL)和6′-唾液酸乳糖(6′-Sialyllactose,6′-SL)。随着HMOs生物合成技术的发展,为了更好的模拟人乳以满足婴儿成长发育中的需要,在美国和欧盟2′-岩藻糖乳糖(2′-Fucosyllactose,2′-FL)和乳-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNn T)已获批添加到婴儿配方粉中。因此,需要开发合适的方法来对婴儿配方粉中的HMOs进行准确的定性、定量分析。本文首先采用多维液相色谱,从人乳中纯化制备得到人乳寡糖后进行详细的结构解析,其次,开发了一种在线HILIC-HILIC方法测定婴儿配方粉中四种人乳寡糖的含量。主要研究内容和结果如下:1.采用多维液相色谱从人乳中分离制备得到34个寡糖单体,其中24个中性人乳寡糖是从聚合度为6-8的二维分离产物中纯化获得,包括IFLNH-III/MFLNH-III/MFLNH-I/MFLNn H等系列同分异构体;酸性人乳寡糖共10个,它们是从一维分离产物中纯化获得,包括3′-SL/6′-SL、LST-a/LST-b/LST-c等系列同分异构体。采用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法(ESI-Q/TOF-MS)对获得的部分人乳寡糖进行了详细的结构解析,并对其中的同分异构体进行了区分。以上结果为复杂人乳寡糖异构体的分离纯化、结构解析及新型寡糖结构的发现提供了理论依据。2.为了实现婴儿配方粉中人乳寡糖快速、准确地测定,我们开发了一种在线HILIC-HILIC的方法来对婴儿配方粉中4种人乳寡糖进行含量分析,其中包括添加的高含量寡糖:2′-FL和LNn T,以及牛乳中内源性的低含量寡糖:3′-SL和6′-SL。通过改进寡糖的提取方法和2-氨基苯甲酰胺(2-AB)衍生化标记,将4种人乳寡糖匹配到两个平行的亲水作用色谱柱进行分离,再分别用紫外和荧光检测器进行检测,解决了寡糖含量差异大而难以同时定量的问题。该分析技术不但可应用于当下不同品牌婴儿配方粉中3′-SL和6′-SL的测定,也可以应用于添加各种不同HMOs的新型婴儿配方粉中寡糖快速、准确的定量。