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研究背景和目的干细胞参与胚胎发育的全过程,同时也存在于一些成体器官中,是由一群未分化的、持续自我更新的细胞组成。间充质干细胞(MSCs)最初分离白骨髓,是一群可以向骨、软骨、脂肪及肌等分化的成体干细胞,这些细胞在多次分裂之后仍具备多向分化的能力。目前MSCs已被许多的研究者,采用不同的方法从众多的器官组织中分离获得。由于这些成体干细胞至今仍没有发现其特定的表面标志物,通常只能采用一系列细胞表面标志的组合来间接进行鉴定,为其高效的体外分离与扩增带来诸多不便。因此,找到真正能体现MSCs自我更新与分化功能的“干性标志”,并阐明其调控途径将有利于对其自我更新与分化的分子机制的理解,有利于MSCs基于细胞治疗的临床应用的发展。最近的研究提示,Trop2或许是一种新的干性标志o Trop2是隶属于TASTCAD基因家族的细胞表面糖蛋白,最初被发现表达于上皮细胞,通常也过表达于一些上皮来源的肿瘤组织,与肿瘤的发生及侵袭密切相关。最近有研究发现Trop2还表达于“祖细胞样的/干细胞样的”人与小鼠的前列腺基底细胞和肝卵圆细胞上,并发现只有这些高表达Trop2的细胞才表现出自我更新和向下分化的潜能。这一现象表明,或许Trop2参与维系这些“干细胞样的”细胞的自我更新。尽管目前对Trop2激活其下游信号通路的确切机制还没有完全明确,但是其胞尾区的P工P2结合域提示我们,PI3K/AKT信号通路可能在其中起某种作用。本研究的目的是：明确是否小鼠基质干细胞也可以合成Trop2,并探讨Trop2对小鼠骨密质来源的MSC生物学作用的影响。研究方法1.采用骨片法分离获取小鼠MSCs,对其进行免疫表型鉴定和成脂及成骨诱导分化。2.通过免疫荧光染色,利用激光共聚焦显微镜观察Trop2在小鼠MSCs细胞膜上的定位表达；通过Western Blot检测小鼠骨密质来源MSCs不同培养时期Trop2的表达变化。3.建立Trop2基因敲除(Trop2 KO)小鼠模型,通过RT-PCR、Southern Blot、WesternBlot等方法分别从DNA、RNA、蛋白表达水平进行鉴定。4.利用流式细胞术检测并比较Trop2基因敲除小鼠来源MSCs和野生型(WT)小鼠MSCs表型差异。5.通过CCK-8和CFSE检测并比较Trop2基因敲除小鼠来源MSCs和WT小鼠MSCs细胞增殖能力的差异。6.通过RT-PCR和real-time PCR比较Trop2基因敲除小鼠来源MSCs和WT小鼠MSCs在经过完全成脂和成骨诱导之后,成脂标志基因PPAR-γ2、Adipsin和成骨标志基因Osteocalcin、Osteopontin的定量表达差异；通过特异性的油红“0”和茜素红染色来判别Trop2基因敲除小鼠来源MSCs和WT小鼠MSCs在经过完全成脂和成骨诱导后脂滴聚集和矿物质沉积的差异。7.通过流式细胞术明确Trop2基因敲除小鼠来源MSCs和WT小鼠MSCs进入细胞周期S期细胞百分数的差异；通过Western Blot明确在传代培养过程中Trop2基因敲除小鼠来源MSCs和WT小鼠MSCs活化AKT表达比率的差异,以及AKT通路下游Cyclin D1的表达差异；利用PI3K抑制剂LY294002处理WT小鼠MSCs后明确活化AKT表达比率的差异以及其下游Cyclin D1的表达差异,并将其与Trop2基因敲除小鼠来源MSCs进行比较,明确Trop2对AKT/Cyclin Dl通路的影响。研究结果1.骨片法可成功体外分离获取小鼠MSCs,所获取的MSCs不仅具备通过经典方法获取的MSCs的免疫表型特征,而且还可以向脂肪和骨诱导分化,是同质性比较一致的间充质干细胞。2.通过激光共聚焦显微镜首次明确观察到MSCs细胞膜上Trop2的定位表达,通过Western Blot发现Trop2的表达量随MSCs体外分裂次数的增加而减少。3.通过RT-PCR、Southern Blot、Western Blot明确鉴定了Trop2基因敲除小鼠的构建成功。4.通过流式细胞术、RT-PCR、real-time PCR、Western Blot等检测发现,Trop2基因敲除小鼠和WT小鼠来源的MSCs在以下方面存在明显差异：(1)通过表型观察发现：与WT MSCs相比,KO MSCs在第一代时同质性较差,CD45阳性细胞(造血系细胞)混杂较多；随着传代至第4代后其同质性渐趋一致。(2)CCK-8和CFSE检测发现：与WT MSCs相比,KO MSCs的增殖速率明显降低,细胞倍增时间明显延长。(3)成脂与成骨诱导实验发现：与WT MSCs相比,KO MSCs在相同诱导之后脂滴聚集减少,矿物质沉积减少；real-time PCR检测发现经完全诱导后WT MSCs较来源于KO MSCs的脂肪标志基因Adipsin、PPAR-γ2和骨标志基因Osteocalcin、Osteopontin分别高出400%、500%、350%和100%。(4)细胞周期：与WT MSCs相比,KO MSCs进入细胞周期S期的细胞比率明显降低。(5) AKT/Cyclin D1:与WT MSCs相比,KO MSCs活化AKT的表达比率明显降低,AKT信号通路下游细胞周期关键节点蛋白Cyclin D1的表达明显降低；但活化AKT和Cyclin D1表达降低程度不及经LY294002阻断AKT通路所引起的降低程度大。结论1. Trop2定位表达在MSCs细胞膜。2. Trop2的缺失可以减弱MSCs的增殖与分化能力。3. Trop2的存在有利于维持AKT的活化状态,继而保护其下游的Cyclin D1不被降解而失活；Trop2的缺失部分抑制了AKT/Cyclin D1通路的活化。