第一部分诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成[目的]寻找诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌形成的方法,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌模型,并观察持留菌形态特征及其对混合生物膜结构的影响。[方法]1.培养生物材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜,分别使用10ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的四环素、庆大霉素、利福平、5-氟胞嘧啶(5-FC)、卡泊芬净、氟康唑、CCCP诱导混合生物膜0.5h、lh、3h促进持留菌形成,再使用10ug/mL的环丙沙星及两性霉素B杀灭非持留菌;超声洗脱混合生物膜,平板菌落计数法比较各种方案诱导产生的持留菌数量,寻找诱导持留菌形成的最佳方案;行药敏检测验证持留菌形成。2.以最佳诱导方案诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型。3.采用生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型,以未经诱导的混合生物膜为空白对照,培养24h后,使用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察持留菌的形态特征;以未经处理的混合生物膜为空白对照,未诱导直接灭菌的混合生物膜为阴性对照,使用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)观察持留菌对混合生物膜结构的影响。[结果]1.根据菌落计数结果,四环素、庆大霉素可诱导表皮葡萄球菌持留,5-FC、卡泊芬净、氟康唑可诱导白色念珠菌持留,以上各药物均为100ug/mL浓度诱导1h效果最佳。100ug/mL利福平诱导表皮葡萄球菌3h也可增加持留菌水平,但效果明显低于上述药物;经各药物诱导后,表皮葡萄球菌、白色念珠菌均无耐药,证明存活微生物均为持留菌。2.使用100ug/mL的四环素、卡泊芬净、5-FC、庆大霉素的诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜1h,可成功构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型;3.SEM观察可见经诱导与未经诱导的混合生物膜表面结构无明显差别,均为以白色念珠菌为骨架,表皮葡萄球菌黏附于表面形成复杂的混合生物膜结构;经诱导的白色念珠菌表面可出现隆起样形态改变,经诱导的表皮葡萄球菌细胞分裂减少,部分体积缩小;活/死菌染色后使用CLSM观察,可见未经诱导的混合生物膜在抗菌药物的作用下被溶解,而经诱导持留菌比例较高的混合生物膜未被溶解;不论生物膜厚薄均可见持留菌,生物膜较薄处持留菌与死菌混杂存在,生物膜较厚处可见大片持留菌。[结论]1.5-FC、卡泊芬净可诱导白色念珠菌持留,四环素、庆大霉素可诱导表皮葡萄球菌持留,诱导效果呈时间-剂量-效应关系,100ug/mL浓度各药物诱导1h时可获得最佳诱导效应;2.使用四环素、庆大霉素、5-FC、卡泊芬净诱导生物材料真菌-细菌混合生物膜可成功构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜持留菌体外模型,解决了既往持留菌数量较少、难以获取的技术难题;3.经诱导的白色念珠菌出现菌体表面隆起样改变,表皮葡萄球菌细胞表现为分裂减少、体积缩小;大量持留菌细胞可以避免混合生物膜被抗菌药物破坏;复杂混合生物膜结构不是持留菌形成的必要条件,但复杂的混合生物膜中可产生更高水平的持留菌细胞。第二部分生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌的持留机制研究[目的]分析生物材料表面表皮葡萄球菌及白色念珠菌混合生物膜中持留菌株与非持留菌株的差异表达基因,寻找可能的持留机制及持留相关基因。[方法]1.以四环素、庆大霉素诱导生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中表皮葡萄球菌持留,5-FC、卡泊芬净诱导白色念珠菌持留,构建生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中持留菌模型,以未经诱导的混合生物膜为空白对照;使用Trizol法分别提取各组细菌与真菌的总RNA,使用OD260/280比值及琼脂糖凝胶电泳分别检测总RNA的纯度与完整度。2.以NCBI基因组数据库的转录组序列作为对比参考序列,对总RNA进行RNA-Seq检测,筛选在两种药物诱导形成的持留菌中均与空白对照呈差异表达的共同差异基因,以排除由各药物引起的与持留无关的基因差异表达,并分析其共同差异基因的功能。3.对共同差异基因进行GO富集分析及KEGG Pathway显著性富集分析,寻找共同差异基因主要参与的代谢途径。[结果]1.成功提取细菌与真菌的总RNA,各组样品总RNA的OD260/280比值均大于1.8,白色念珠菌28s、18s rRNA条带及表皮葡萄球菌23s、16s rRNA条带均完整,证明总RNA纯度、完整度较好。2.生物材料表面真菌-细菌混合生物膜中白色念珠菌持留菌共同差异表达基因684个,表皮葡萄球菌持留菌共同持留菌差异表达基因102个;白色念珠菌持留菌的差异表达基因功能多为增强核糖体功能,减慢细胞分裂,减弱毒力,增强对各种应激的耐受性,且细胞外基质蛋白1(Extracellular matrix 1,ECM1)等黏附相关基因显著上调。表皮葡萄球菌持留菌的DnaK与SceD基因上调,可增加细菌对抗菌药物及不良环境的抵抗能力,但未见其它共同差异表达基因。3.GO富集分析结果显示,白色念珠菌持留菌上调的基因主要富集于分子功能:甲基转移酶活性,转移一个碳基的转移酶活性,核苷三磷酸酶活性,焦磷酸酶活性,ATP耦合酶活性;生物过程:甲基化,rRNA处理,rRNA代谢过程,核糖体形成,ncRNA代谢过程等GO Term;白色念珠菌下调基因及表皮葡萄球菌差异表达基因均无显著富集。KEGG富集分析结果显示:白色念珠菌持留菌上调基因主要富集于:真核生物核糖体的生物发生,RNA聚合酶,嘧啶代谢,嘌呤代谢,ATP结合盒式转运蛋白等通路;白色念珠菌下调基因主要富集于:磷酸戊糖途径,淀粉和蔗糖代谢,谷胱甘肽代谢,磷酸肌醇代谢,RNA降解等通路。表皮葡萄球菌上调基因富集于RNA降解通路,下调基因无明显富集。4.RT-qPCR结果显示,白色念珠菌ECM1基因在各实验组中均较空白组上调;PLC1、PRR2、SAC6、TOR1基因均较空白组下调。表皮葡萄球菌的DnaK基因在各实验组均上调。[结论]1.生物材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜中持留菌的持留是由多因素、多基因共同引起的以增加微生物对外界不良刺激的耐受性及生存能力为目的的复杂过程,该过程伴有细胞内资源的重新分配,并可能导致微生物的代谢、分裂及致病能力下降。2.白色念珠菌黏附于生物材料表面后,可通过下调PRR2、SAC6、PLC1等基因,形成对多种环境压力耐受但细胞生长抑制、功能低下的持留菌细胞,而ECM1可通过促进白色念珠菌黏附,其可能是白色念珠菌持留的关键基因。3.四环素及庆大霉素可能通过不同基因促使表皮葡萄球菌持留,而表皮葡萄球菌持留菌形成后,可通过上调DnaK基因获得耐受多种环境压力的能力。