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第一部分:解剖仿生人工骨修复兔胫骨完全大段骨缺损的研究研究目的:本实验在支架材料研究基础上设计3D打印解剖仿生人工骨修复和重建兔胫骨完全大段骨缺损,模拟兔胫骨的结构引导组织的再生和重建,以期改善人工骨支架修复负重部位骨缺损时存在的对线对位不良、应力遮挡等局部解剖匹配不良所致缺陷,也为进一步支架负载细胞或生物分子的仿生学研究奠定基础并更好地模拟临床重建研究。研究方法:1.采用Mimic软件获得拟截骨部位骨结构的三维电子模型,利用熔融沉积制造(FDM)制备羟基磷灰石/聚己内酯(HA/PCL)解剖型支架;2.将15只6月龄新西兰大白兔分为3组,空白组3只,对照组和实验组均6只,分别制备长约1.2cm的胫骨大段骨缺损,其中空白组缺损处旷置,对照组缺损处将截骨原位放回,实验组缺损处放置解剖仿生人工骨,并用实验设计的小钢板螺钉系统固定。3.分别于术后4、12周通过影像学、组织学和检测大体标本畸形的方法来观察骨缺损模型愈合过程。结果:影像学检查结果示术后4、12周两组骨缺损处移植体未见明显移位和成角畸形,自体骨骨折处修复较好;组织学检查示术后4周实验组骨断端及支架内有少量新生骨填充,术后12周重建支架内新骨生成明显增多并且部分矿化;大体观察:术后4、12周时两组骨缺损处骨移植体无明显移位、成角畸形。结论:本实验采取的3D打印解剖仿生人工骨构建的兔胫骨完全大段骨缺损模型稳定性较好,该解剖仿生人工骨具有良好的骨引导性能,为进一步支架负载细胞或生物分子的研究奠定基础。第二部分:载rhVEGF165/rhBMP-2热致温敏水凝胶体系生物学性能检测研究目的:检测所制PLGA-PEG-PLGA热致温敏水凝胶载促血管生成因子(rhVEGF165)或/和促成骨细胞因子(rhBMP-2)在体内外的缓释规律及该载药凝胶于体内外对成骨细胞增殖、分化的影响。研究方法:首先利用凝胶色谱和流变仪对所制备的温敏水凝胶(PLGA-PEG-PLGA)的结构和性能表征,确定其溶胶-凝胶转化相。于溶胶相时,将该水凝胶与讯息因子(rhVEGF165、rhBMP-2)混合,实现对细胞因子溶解包埋。通过Elesa检测其凝胶相体外静止状态下降解缓释情况;通过RT-PCR检测该凝胶相对成骨细胞的生物学影响;于小鼠皮下注射检测其体内凝胶相降解规律和异位骨化情况。结果:1.该温敏性水凝胶是一种匀质的可逆性溶胶-凝胶热致聚合物,具有适宜的相变温度(27-30℃);2.该载讯息因子凝胶于体外静止模拟体液中降解超过21天,其讯息因子释放过程中未见明显"突释效应";3.该温敏性水凝胶植入小鼠皮下21-28天左右不能完全降解,可实现局部较长时间的药物释放效应;3.载rhBMP-2和载rhBMP-2、rhVEGF165水凝胶能够于皮下14天左右诱导异位成骨,且两组异位成骨能力于28天时无明显差异。结论:该可注射性温敏性水凝胶具有良好生物可降解性,可作为rhBMP-2、rhVEGF165等载体并模拟自然骨修复过程相关讯息因子的释放;本实验所释放rhBMP-2和rhVEGF165之间存在协同效应,且rhVEGF165可能诱导新骨中更多血管生成,有利于成骨相关细胞及讯息因子的迁移,促进骨生成;该水凝胶可减少rhBMP-2、rhVEGF165随体液扩散、将减少体内酶解消耗,降低药物的最小有效浓度和并发症。第三部分:载rhBMP2/rhVEGF165凝胶的解剖仿生人工骨修复兔胫骨大段骨缺损的研究研究目的:本文利用3D打印解剖仿生人工骨支架负载凝胶载药体系构建一种"支架复合讯息因子"策略修复骨缺损,通过讯息因子的生物学活性赋予该人工骨支架良好的骨诱导性能,以期更好地促进损伤部位骨再生、人工骨支架与自体骨整合,更好地重建局部器官结构完整性和功能,避免骨不连等并发症。研究方法:1.将18只6月龄新西兰大白兔分为3组,空白支架组(N组)6只,载rhBMP2复合支架组(B组)6只,载rhBMP2和rhVEGF165复合支架组(VB组)6只;2.将凝胶载药体系通过负压载入3D打印的解剖仿生人工骨空隙内;3.分别制备长约1.2cm的胫骨完全骨缺损,将3组人工骨支架分别移植到所建骨缺损处进行重建和修复;4.术后4周、12周行影像学观察和大体观察,比较3组骨缺损处局部骨修复和重建情况。结果:X线摄片显示:三组样本于术后1月、3月X片未见明显成角、移位等畸形,且术后3月X片较1月时显示缺损处新骨生成增加。术后3月取材的大体标本显示:3组均能提供良好的支撑功能,无移位、成角畸形;3组均存在不同程度的骨痂,其中VB组可见更多的骨痂包绕解剖仿生人工骨,其骨-支架界面分不出,界面处融合最紧密;B组的解剖仿生人工骨周围骨痂较VB组少,其骨-支架界面尚能辨认,界面处融合较紧密;N组的解剖仿生人工骨周围骨痂表现为3组中最少的,其骨-支架界面辨认清楚,界面处部分融合紧密。CT重建影像可见VB组周围的骨痂包绕最密集,其骨-支架界面分不出;B组周围骨痂不如VB组密集,但较N组密集,其骨-支架界面辨认清楚,界面处基本全面融合;N组周围骨痂最少,其骨-支架界面辨认清楚,界面处部分融合。结论:1.该解剖仿生人工骨负载rhBMP2、rhVEGF165凝胶的复合体系可显著促进兔胫骨大段完全骨缺损早期修复和后期骨整合,具有替代自体骨移植的良好前景。2.本实验所释放rhBMP-2和rhVEGF165之间存在协同效应,且rhVEGF165可能诱导人工骨中更多血管生成,有利于成骨相关细胞及讯息因子的迁移,促进优质骨生成。