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本研究根据文献和GenBank数据库中已报道的甘蔗宿根矮化病菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli,Lxx)的基因序列,合成了扩增该病菌16S-23SrDNA基因间隔区的种特异引物对PLxx,以及扩增该病菌致病相关基因(莽草酸盐5-脱氢酶,推导的糖类转运蛋白,DNAa促旋酶A亚基,DNA聚合酶Ⅲβ亚基)片段的3对特异引物P2、P3和P4。以感染宿根矮化病的成熟蔗茎维管束组织总DNA提取物为模板进行PCR扩增,上述4对引物均能产生预期大小的扩增产物,序列测定和分析表明,这些扩增产物序列均与已报道的Lxx相应区段高度同源,从分子水平证实我国甘蔗已受到Lxx侵染。在此基础上,建立并优化了甘蔗植株体内Lxx的PCR检测技术,其中引物对PLxx检测效果最好,而引物对PLxx和P4组合具有双重PCR检测效果。以含PLxx扩增产物的重组质粒为模板,随机引物法制备地高辛核苷酸标记探针,建立了Lxx的核酸斑点杂交检测技术。采用文献报道的Leifsonia属通用引物对PLG、和PLxx组合建立了Lxx的巢式PCR检测技术。巢式PCR检测灵敏度比常规PCR、双重PCR和地高辛核苷酸标记斑点杂交约高100倍。上述结果为甘蔗宿根矮化病菌检测提供了多种可行的方法。
对随机采自广东、海南等地田间的甘蔗茎节部组织中的Lxx进行常规PCR检测,结果发现广东田间甘蔗样品阳性率为90%(180/200),明显高于海南样品的阳性率40%(16/40)。
本研究还在国内首次应用DM培养基对获得Lxx人工纯培养,并对其进行了菌落形态观察、革兰氏染色、显微镜观察、培养特性及PCR分子鉴定等研究。结果表明,28℃培养10天始见大小约0.1-0.3mm的乳白色,圆形菌落,稍隆起,边缘整齐,表面光滑湿润。菌体革兰氏染色呈阳性,在光学显微镜下呈短棒状,大小(0.1-0.45)×(0.1-1.0)μm;少部分菌体近球形,直径0.1~0.25μm。该病菌不能在PDA、PSA等培养基上生长,在DM培养基上生长缓慢,采用PLxx引物对菌体进行PCR扩增,可获得单一明亮的目的电泳条带,初步鉴定其为Lxx。
对糖蔗(粤糖93159)、黄皮果蔗(Badila)和黑皮果蔗(Badila)进行了种茎热水处理脱菌试验。结果表明,双芽段蔗茎经50℃、2h热水处理,黑皮果蔗完全失去发芽能力,糖蔗无脱菌效果,黄皮果蔗脱菌率为50%。对热处理种茎再生苗进行生长及生理生化指标测定,结果显示,热处理对再生苗早期生长具抑制作用,对中后期生长无不利影响,尤其是黄皮果蔗再生苗。干旱胁迫试验也证实,脱菌种茎再生苗抗旱能力有所增强。
本研究为我国甘蔗宿根矮化病的大规模田间调查、病菌的深入研究及病害防治提供了技术及材料基础,为今后继续研究创造了条件。