研究目的: 探讨年龄因素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)促血管新生作用的影响及其可能机制。 方法与结果: 1．年龄因素对BMSCs移植治疗大鼠后肢缺血的影响分离培养年轻(6-8周龄)和年老Lewis(60-64周龄)大鼠的BMSCs，采用流式细胞计数分析检测BMSCs表面抗原标志的表达。通过结扎并切断右侧髂总动脉、股动脉近端及股浅动脉远端，建立大鼠后肢缺血模型。随机分为六组，每组10只大鼠，YY组，年轻供体BMSCs移植到年轻大鼠；OY组，年老供体BMSCs移植到年轻大鼠；YO组，年轻供体BMSCs移植到年老大鼠，OO组，年老供体BMSCs移植到年老大鼠；年轻对照组(YC组)和年老对照组(OC组)，基础培养液(IMDM)注射到年轻及年老大鼠。术后一天，右侧后肢内收肌局部注射5×10<6>BMSCs或等量的IMDM。于术后、移植后7、14及21天，激光多普勒血流分析仪扫描后肢，了解肢体远端血流恢复情况。于移植后21天，处死动物后取股内侧肌制作病理切片，抗vWF免疫荧光染色及抗α-SMA染色，了解毛细血管密度及小动脉密度。获取双侧腓肠肌，了解右侧腓肠肌萎缩情况。 年轻及年老供体BMSCs均阳性表达CD29和CD90.1，部分阳性表达CD117，而CD34及CD45均呈阴性，年轻细胞的cD117表达率明显高于年老细胞，其余细胞表面标志物表达率无统计学差异。激光多普勒成像指数(LDPI index)定量分析显示：术后组间无明显差别；移植后21天，与对照组比较，各细胞移植组的肢体远端血流供应均明显改善，且年轻供体BMSCs明显高于年老供体BMSCs。与对照组比较，各移植组的毛细血管密度及小动脉密度均明显增加，年轻供体BMSCs组高于年老供体BMSCs组。与对照组比较，各移植组腓肠肌的萎缩率均显著下降，年轻供体细胞组明显高于年老供体细胞组。 2．年龄因素影响BMSCs促血管新生作用的可能机制 2．1离体实验 2．1．1缺氧缺血清环境下，年龄因素对BMSCs旁分泌(FGF-2及VEGF)功能的影响 取自年老及年轻供体BMSCs随机分为4组：年轻细胞缺氧缺血清组(YH组)，年老细胞缺氧缺血清组(0H)，年轻细胞对照组(YN组)，年老细胞对照组(ON组)，收集条件培养液，ELISA测定FGF-2及VEGF的蛋白水平。 结果显示，YN组及ON组的VEGF及FGF-2水平无明显差别，与YN组及ON组比较，YH组及OH组上述蛋白水平均有不同程度的升高，但OH组的FGF-2水平升高无统计学差异，YH组明显高于OH组。 2.1.2 缺氧缺血清环境下，年龄因素对细胞凋亡的影响 取自年老及年轻供体的BMSCs在缺氧缺血清下培养24小时，TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果显示，年老供体BMSCs的凋亡率明显高于年轻供体BMSCs。 2.2在体实验 2.2.1移植BMSCs在缺血肌肉组织中分化的测定： 将PKH26标记BMSCs移植到缺血组织。移植后21天用荧光显微镜和共聚焦显微镜观测细胞分化情况。 在荧光显微镜下观察，可见少量的BMSCs呈PKH26、DAPI、vWF或α-SMA三阳性。在共聚焦显微镜下观察，未见BMSCs呈PKH26、DAPI、vWF或α-SMA三阳性，2.2.2 年龄因素对移植BMSCs旁分泌和EPC动员的影响： 细胞移植后7天，获取外周血及脾脏，用流式细胞仪检测CD34圾KDR双阳性EPC数量；获取右侧内收肌测定FGF-2及VEGF的蛋白水平。 结果显示：与对照组比较，细胞移植组的外周及脾脏中EPC数量显著地增加，年轻供体BMSCs移植组明显高于年老供体BMSCs移植组；与对照组比较，BMSCs移植组增加了缺血骨骼肌组织的VEGF和FGF-2水平，年轻供体BMSCs移植组明显高于年老供体BMSCs移植组。 2.2.3 年龄因素对移植BMSCs在缺血肌肉组织中生存的影响： 将Brdu标记的BMSCs移植到缺血肌肉组织中。移植后21天检测移植局部BrdU阳性细胞数。 结果显示：YY组的BrdU阳性BMSCs数量明显高于OY组、YO组及OO组；与OO组比较，OY组及YO组的BMSCs数量明显增多，OY组及YO组组间无差异。 结论 1．无论是年轻供体还是年老供体BMSCs移植均能促进年老及年轻受体大鼠后肢缺血模型的血管新生，改善肢体远端血液供应和减轻缺血腓肠肌的萎缩。 2．年轻供体BMSCs促进血管新生作用明显优于年老供体BMSCs。 3．年龄因素影响BMSCs促血管新生的可能机制： (1)年轻供体BMSCs在体内和体外能释放更多的VEGF和FGF-2。 (2)年轻供体BMSCs动员EPC的作用优于年老供体BMSCs。 (3)年轻供体BMSCs在生缺血缺氧条件下生存率明显高于年老供体BMSCs。