M2-型丙酮酸激酶对肝癌细胞增殖的影响

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背景:肿瘤细胞无论氧气存在与否都主要依赖糖酵解进行糖代谢,这一糖代谢异常现象早在20世纪20年代由德国生物学家Otto Warburg发现,故称为Warburg效应。丙酮酸激酶促进有氧糖酵解,M2-型丙酮酸激酶在许多癌细胞中高度表达。Warburg效应是肿瘤的特征之一,PKM2的糖酵解作用已研究较透彻,其作为蛋白激酶等非糖酵解功能在肿瘤生长中的作用仍有待进一步研究。目的:初步探讨PKM2在肝癌组织中的表达,并研究PKM2在肝癌发生、发展中的作用及相关机制。方法:1)荧光定量PCR (Real-time PCR),免疫组化(IHC)比较PKM2在原发性肝癌和癌旁组织中mRNA和蛋白的表达水平;2)PKM2干扰和过表达质粒的构建,采用磷酸钙法包装成慢病毒;3)细胞培养和慢病毒感染肝癌细胞株(HepG2);4)荧光定量PCR (Real-time PCR),蛋白印迹法(Western blot)比较感染前后肝癌细胞株中PKM2及相关基因的mRNA和蛋白的表达水平;5)CCK8和平板克隆法检测细胞增殖活性;6)流式法检测细胞的凋亡水平。结果:1)PKM2在肝癌组织中高表达a)实时荧光PCR显示肝癌组织中(106/115)PKM2基因水平高于癌旁组织,P<0.05。b)免疫组化染色示肝癌组织中PKM2蛋白水平高于癌旁组织,P<0.05。2)PKM2水平的变化对肝癌细胞株(HepG2)增殖能力的影响a)肝癌细胞株HepG2感染含有PKM2干扰序列PKM2-shRNA (PKM2-shRNAl、PKM2-shRNA2)、对照序列control-shRNA (vector1)的慢病毒,实时荧光PCR、蛋白印记表明慢病毒PKM2-shRNA2相比慢病毒PKM2-shRNAl,感染后的HepG2细胞的mRNA水平及蛋白水平明显减低,PKM2-shRNA1作为干扰质粒序列;b)慢病毒感染的肝癌细胞株HepG2,与阴性对照组相比,HepG2-pLL3.7-PKM2-shRNA组PKM2mRNA和蛋白表达明显下降,HepG2-pLV-GFP-PKM2组PKM2mRNA和蛋白表达明显升高,P<0.05;c)PKM2促进肝癌细胞增殖:CCK8法及平板克隆实验发现,慢病毒感染的肝癌细胞株HepG2与阴性对照组相比,HepG2-pLL3.7-PKM2-shRNA组细胞增殖能力明显下降,HepG2-pLV-GFP-PKM2组细胞增殖能力明显增强,P<0.05;3)PKM2可能通过磷酸化STAT3增加HIF-1α转录,促进肝癌细胞增殖;a)实时荧光定量PCR显示肝癌组织中,HIF-1α基因水平高于癌旁组织,P<0.05;b)免疫组化染色示肝癌组织中HIF-1α蛋白水平高于癌旁组织,P<0.05。c)实时荧光PCR及蛋白印迹检测,感染含有PKM2干扰序列慢病毒的HepG2细胞,HIF-1α的mRNA及蛋白水平明显减低,P<0.05;d) Western blot结果显示,过表达PKM2组(HepG2-PKM2)STAT3(tyrosine705)磷酸化水平明显高于HepG2野生型组,而PKM2干扰组(HepG2-PKM2-sh RNA)低于HepG2野生型组。4)PKM2可能通过激活p65改变Bcl-xL的表达a)实时荧光定量PCR显示肝癌组织中Bcl-xL基因水平高于癌旁组织,P<0.05;b)实时荧光PCR及蛋白印迹检测,感染含有PKM2干扰序列慢病毒的HepG2细胞,Bcl-xL的mRNA及相关蛋白水平明显减低,P<0.05;c)相关细胞株经过IκB激酶特异性抑制剂PS1145处理,蛋白印迹实验表明Bcl-xL水平发生变化;d)流式法检测细胞凋亡,提示干扰PKM2(HepG2-PKM2-shRNA)组,细胞的凋亡相比对照的野生组相对(HepG2-control)增多,而过表达(HepG2-PKM2)组相对减少。结论:1)PKM2在肝癌组织中的表达高于癌旁组织;2)体外实验证实PKM2促进肝癌细胞的增殖;3)PKM2可能通过STAT3/HIF-1α,Bcl-xL相关机制促进肝癌细胞增殖。
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