【摘 要】
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CPP(Cystein-rich polycomb-like protein or Tesmin/TOS1-like)是一种小型转录因子家族的成员,研究表明CPP基因可以参与植物体内的胁迫响应过程。同时,本实验室前期通过原生质体瞬时表达体系研究表明玉米CPP转录因子—ZmCPP2可以增强玉米的抗氧化防护。为了进一步阐明ZmCPP2基因在玉米响应胁迫中的作用机理,ZmCPP2玉米突变体材料的构建变得
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CPP(Cystein-rich polycomb-like protein or Tesmin/TOS1-like)是一种小型转录因子家族的成员,研究表明CPP基因可以参与植物体内的胁迫响应过程。同时,本实验室前期通过原生质体瞬时表达体系研究表明玉米CPP转录因子—ZmCPP2可以增强玉米的抗氧化防护。为了进一步阐明ZmCPP2基因在玉米响应胁迫中的作用机理,ZmCPP2玉米突变体材料的构建变得十分重要。近些年,农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法受到越来越多的重视,但此方法的转化率比较低。因此,本文通过构建ZmCPP2过表达玉米,首先优化了农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系,并初步分析了过表达ZmCPP2玉米的抗旱性,获得以下研究结果:研究表明,菌液浓度(OD600)、真空渗透压力(MPa)、真空处理时间(min)和乙酰丁香酮(AS)浓度(μM)是影响玉米茎尖遗传转化效率中最重要的四种影响因素。用单一变量法分别对这四种因素进行一定范围内的优化,结果表明:当菌液浓度OD600为0.65、真空渗透压力为0.05 MPa、真空处理时间为3 min和AS浓度为150μM时分别具有较高的遗传转化效率。随后,我们分别将优化的这四种因素整合在一起进行玉米茎尖遗传转化时发现最终的出芽率约为10.6%、阳性率约为8.7%,虽然最终的遗传转化效率没有呈现倍数性的增长但是与单因素变化相比有更高的遗传转化效率。所以,菌液浓度OD600为0.65、真空渗透压力为0.05 MPa、真空处理时间为3 min和AS浓度为150 μM为最佳的遗传转化条件。另外,在三叶期时,通过对玉米喷施不同浓度的除草剂Basta,发现75 mg/L的Basta为此时期的最适筛选浓度。为了确定是否成功获得过表达ZmCPP2玉米材料,对遗传转化的玉米植株进行除草剂Basta筛选和PCR检测鉴定,证明ZmCPP2已经成功整合入玉米基因组中,获得了 T0代ZmCPP2过表达玉米植株以及T1、T2代ZmCPP2过表达玉米种子。通过荧光定量PCR和western blot证明ZmCPP2基因和ZmCPP2蛋白在ZmCPP2过表达玉米中有较高的表达量并且能稳定过表达。对ZmCPP2过表达玉米进行干旱处理,在干旱胁迫下观察其生长表型并进行生理生化指标的测定。结果表明:对ZmCPP2过表达玉米幼苗进行自然干旱处理7 d并复水后,ZmCPP2过表达玉米的存活率显著高于野生型;同时测定了干旱胁迫下ZmCPP2过表达玉米的MDA含量和电解质泄露率发现,在干旱胁迫下,ZmCPP2过表达玉米的MDA含量和电解质泄露率明显少于野生型。以上结果表明,过表达ZmCPP2可以显著增强玉米对干旱的耐受性。
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