背景及目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,已成为全球性的严峻公共卫生问题,迄今尚未发现有效手段来解决肝癌防治这一世界性难题。机体免疫状态与HCC病程进展密切相关,因此,加强HCC的基础研究,特别是免疫学研究,是当前HCC防治中的重要命题。作为机体重要的天然免疫细胞,自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)对抵御肝脏恶性转化细胞的侵害具有十分重要的意义。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤不受主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)限制,也不需要预先抗原接触或显示任何记忆反应。它活化后经其天然细胞毒性和产生高水平细胞因子来发挥抗肿瘤效应,并调节T、B淋巴细胞和抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)功能以调控机体免疫应答。因此,以NK细胞为基础的过继免疫治疗作为一种安全有效的治疗措施,已成为肿瘤生物治疗发展中最活跃的领域之一,对改善肿瘤患者生命质量和延长生存有效期具有非常积极的作用。临床实践证实,NK细胞过继免疫治疗HCC患者已取得初步疗效,是提升HCC治疗效果的重要突破点之一。其中,NK细胞过继输注后能否有效迁徙富集于肿瘤病灶区并发挥杀伤功能是影响其治疗效果的关键。针对这一问题,本研究充分发挥活体生物发光成像(Bioluminescence imaging,BLI)在免疫细胞及肿瘤细胞标记方面的优势,建立NK细胞及肝癌细胞体内分子影像监测技术,展开NK细胞过继输注后分布迁徙和归巢增殖等生物学活性的系统研究,分析NK细胞过继免疫治疗肝癌的疗效,并通过水动力高压转染(Hydrodynamics-based transfection)Fms样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 Ligand,Flt-3 Ligand,FL)调控肝脏组织中趋化因子配体的表达,以诱导其向肝脏组织的迁移并发挥杀伤肿瘤细胞的功能。本课题的开展将为HCC的治疗提供理论基础和新的思路,对辅助HCC治疗的临床决策及临床个体化治疗方案的选择具有重要意义。方法及成果:本研究主要围绕以下几个方面展开一.Fluc~+NK细胞体内扩增及示踪技术平台的建立过继输注的NK细胞在体内发挥作用受多种因素影响,其中一个重要因素就是免疫细胞能否到达靶器官,实现与肿瘤细胞的直接接触,从而有效活化并杀伤靶细胞。了解过继输注的NK细胞在活体内的分布迁徙规律对其发挥免疫调节、杀伤靶细胞的作用来说非常重要。虽然NK细胞过继免疫治疗已取得了可喜进展,但由于缺乏有效的生物标记,阻碍了对NK细胞在体内存活、增殖及迁移的实时动态监测。鉴于NK细胞转染难度较大,本研究引入组成性表达萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)的C57BL/6J转基因小鼠为供者NK细胞来源。获得足够的细胞数量是实施NK细胞过继免疫治疗的首要环节,目前已发展多种NK细胞扩增技术。已知多种细胞因子、生长因子和免疫调节剂均可刺激NK细胞扩增,但现有扩增方案都需要体外长期激活及大规模培养,费用昂贵。为了更为经济、简单、有效的获得大量小鼠NK细胞,本研究拟采用水动力高压转染技术向小鼠注射FL表达质粒以达到体内扩增NK细胞的目的。FL作为一种关键的早期造血生长因子,通过与造血干细胞表面Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3,Flt3)结合,进而刺激细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)、树突状细胞(Dendritic cells,DCs)、NK细胞在体内的增殖、分化和成熟。为探究水动力高压转染FL表达质粒能否扩增小鼠脾脏NK细胞,以及是否会对其活性和表型产生影响,于注射后1 w对不同转染次数下的小鼠行解剖取脾观察,结果显示连续两次水动力高压转染FL表达质粒后,小鼠脾脏明显增大、颜色加深。对其研磨制成脾细胞悬液,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对脾NK细胞数量、比例、活性及表型变化情况的检测结果显示,与水动力高压转染空载体(Vector)相比,连续两次FL处理可使小鼠脾淋巴细胞总数增加(6.02±1.15)倍,NK细胞亚群比例增加(2.07±0.39)倍,NK细胞亚群绝对数量增加(12.49±2.39)倍,扩增效果显著。与此同时,FL处理后小鼠脾淋巴细胞的细胞活性标志物CD69表达、NK细胞亚群的表面特异性标志物Fas Ligand、NKG2D和NKp46荧光强度的表达均无明显变化。上述指标说明,FL在肝细胞内的表达能够扩增小鼠脾NK细胞的数量及比例,但并不影响其活性及表型的变化,满足实验需求。基于抗原抗体反应高度特异性的优点,联合应用偶联大鼠抗小鼠CD5(Ly-1)MicroBeads和EasySep~TMM Mouse NK Cell Isolation Kit的优化免疫微磁珠分选(Magnetic activated cell sorting,MACS)技术,从扩增后的供者小鼠脾脏分离出大量、纯度可达(83.81±0.92)%的NK细胞。将分离出的带有Fluc标记的供者NK细胞过继输注到受者小鼠体内,通过BLI建立NK细胞的体内分子影像监测技术平台。结果显示,Fluc~+NK细胞过继输注后其荧光信号可在受者小鼠体内持续~16 d;整体呈现逐渐增强,至8 d全身分布最广、信号最强,后又逐渐下降的抛物线趋势。对其器官及淋巴结的解剖分析结果同上,且高峰时期可在小鼠肺、脾、肝和颈部、腋窝、坐骨淋巴结等部位监测到较为明显的Fluc~+NK细胞荧光信号。该部分通过对Fluc标记的NK细胞体内示踪技术平台的建立,为后续NK细胞过继免疫治疗研究奠定了坚实的理论基础和研究方向。二.FL促进过继输注的NK细胞向肝脏迁移及其作用机制研究如何诱导治疗性NK细胞有效迁移至肿瘤病灶区并发挥杀伤功能是提高其过继免疫治疗效果的关键,同时哪些因素会影响其有效迁移入病灶区的问题仍缺乏深入研究。研究证实,NK细胞的迁徙能力受趋化因子等多种因素的影响,而FL在体内外均能够调控趋化因子配体的表达。因此,本研究假设:FL在肝脏的高效表达能调控肝内趋化因子配体的表达,并促进NK细胞向肝脏迁徙。为验证该假设,首先从小鼠尾静脉快速(5~8 s内)注射大量含有FL表达质粒的生理盐水,从而实现目的基因在小鼠肝脏长期且高效的表达。对转染24 h后小鼠器官的免疫组化检测结果分析可知,水动力高压转染可使小鼠肝大量表达FL目的质粒,其转染效率高达40%,而肺、脾则少量表达,肾几乎不表达。为明确FL在肝细胞内的表达对小鼠肝脏NK细胞的影响,于小鼠转染FL表达质粒24 h后解剖取肝,研磨制成细胞悬液后应用Percoll不连续密度梯度分离方法对肝淋巴细胞进行分离,FCM对肝NK细胞数量、比例、活性及表型变化情况的检测结果显示,FL处理后小鼠NK细胞CD69表达阳性细胞和Fas Ligand、NKG2D表型阳性细胞的平均荧光强度(Median fluorescence intensity,MFI)显著增强,且增强倍数分别为(1.26±0.03)、(1.60±0.23)和(1.52±0.11)倍。上述指标说明,FL在肝细胞内的表达并不会对小鼠肝NK细胞的数量及比例产生影响,但却能明显提高其CD69表达阳性细胞和Fas Ligand、NKG2D表型阳性细胞的MFI,提示FL有增强NK细胞杀伤能力的潜在可能。随后,通过BLI监测FL肝脏表达对NK细胞体内迁徙的影响。结果显示,FL处理能在NK细胞过继输注后的24 h内显著促进其向肝脏的迁移,且该促进作用在12~14 h最为显著,解剖器官成像可知小鼠肝、肺荧光信号显著增强。为解释这一现象,应用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,q-PCR)对水动力高压转染FL表达质粒后肝脏组织趋化因子配体的mRNA表达水平进行检测。结果显示,CCL7和CXCL10的mRNA表达水平明显上调,免疫组化结果也对该q-PCR结果进行了验证。因此,在FL促进NK细胞向肝脏迁移的过程中,肝脏组织中趋化因子配体CCL7、CXCL10与其相应NK细胞表面趋化因子受体的相互作用在NK细胞向肝脏的趋化募集中发挥重要作用。三、分子影像技术监测NK细胞过继免疫治疗肝癌的作用效果建立合适的HCC模型是开展NK细胞过继免疫治疗的基础。肝脏原位肿瘤模型是研究肝癌细胞生长、转移及免疫治疗效果的重要工具。为实时监测肝癌细胞在体内的存活、生长、分布、迁移情况,本研究利用pCMV-Luciferase-ACGFP慢病毒感染、嘌呤霉素加压筛选的方式稳筛出具有生物发光活性的ACGFP-Luc-Hepa 1-6细胞系,成像系统体外检测其细胞数量与光通量值之间存在显著的线性相关关系,相关系数R~2=0.971。Matrigel基质胶中含有的高浓度蛋白对小鼠原位HCC模型的建立具有良好的促进作用。本研究采用1/2比例的Matrigel/DMEM混合液结合优化的肝脏直接注射法技术建立Fluc标记的肝癌细胞原位肿瘤小鼠模型。结果显示,小鼠接种肝区荧光信号于接种一周后显著增强,并随时间推移呈现快速递增趋势。解剖成瘤小鼠HCC组织行病理学检测可知,HCC标本较正常肝组织体积扩大3~4倍,肿瘤位于肝叶上,有包膜或包膜不完整;形态不规则,表面凹凸不平、质地较硬,呈大小不等的结节状改变,以浸润生长为主;肿瘤表面红白相间,外周有增粗明显的血管,肿瘤直径>1 cm时中心可见干酪样坏死。HE染色结果可见肿瘤细胞胞浆疏松、排列不规则,间质内肿瘤血管丰富,细胞核深染、核质比例失调,异型性显著,呈团块状分布。上述结果证实了小鼠原位HCC模型的成功建立,且该模型的成瘤率在90%以上,能够满足实验所需。基于前期的NK细胞分离纯化技术及可视化肝脏原位肿瘤模型,充分发挥BLI在肝癌细胞标记方面的优势,随后展开NK细胞过继免疫治疗HCC作用效果的研究。结果显示,NK细胞过继输注能有效减缓小鼠HCC的生长速度,使肿瘤病灶缩小甚至消退,并延长肿瘤小鼠的存活率及存活时间。在NK细胞过继免疫治疗HCC的实验进程中,肿瘤病灶区的NK细胞数量及活性是影响其治疗效果的两大关键因素。上述研究证实,FL能扩增NK细胞,促进过继输注的NK细胞向肝脏迁移,并增强肝脏NK细胞活性,提示FL有可能会促进NK细胞过继免疫治疗HCC的作用效果。为验证上述设想,将小鼠原位HCC模型水动力高压转染FL,并过继输注NK细胞后,分析FL对NK细胞杀伤效果的影响。结果显示,FL具有良好的抗肿瘤作用,能够促进NK细胞过继输注后对HCC的杀伤效果,有利于肿瘤病灶的消退和癌变组织的恢复,这一发现对NK细胞过继免疫治疗HCC实体肿瘤的进展具有重要的推动意义。结论及意义:基于免疫细胞和肝癌细胞的体内成像示踪技术,展开NK细胞过继输注后分布迁徙和归巢增殖等生物学活性的系统研究,建立Fluc标记的肝癌细胞原位肿瘤模型平台,分析NK细胞过继免疫治疗HCC的疗效。此外,通过水动力高压转染FL表达质粒扩增NK细胞数量,同时上调肝脏组织中趋化因子配体的表达水平诱导NK细胞向肝脏的迁移,促进NK细胞过继输注后对HCC的杀伤效果,本研究为HCC的控制和治疗提供新的思路,为NK细胞过继免疫治疗HCC的发展提供新的研究方向。