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第一部分:PCSK9敲除小鼠骨表型研究研究目的:本实验第一部分通过PCSK9基因敲除鼠,探究PCSK9敲除对小鼠长骨发育的影响。材料与方法:从南京动物模式中心购买6周龄C57BL/6J野生型小鼠及PCSK9敲除鼠,通过杂合交配获取实验所需PCSK9敲除鼠(PCSK9-/-)及野生型（WT）同窝子代小鼠,并用PCR鉴定基因型。阿尔辛兰-茜素红S染色检测出生后1周PCSK9-/-及同窝WT小鼠全身骨骼形态。Micro-CT及HE染色检测6～8周龄PCSK9-/-及同窝WT小鼠股骨远端骨小梁及皮质骨骨量。实验结果:阿尔辛兰-茜素红S染色显示PCSK9-/-与同窝WT小鼠相比,四肢骨显著增大。Micro-CT及HE显示PCSK9-/-小鼠股骨远端骨小梁数量（Tb.N）增加,骨小梁体积（BV/TV）增大,骨小梁分离度（Tb.Sp）减小,骨小梁厚度（Tb.Th）未见明显差异,皮质骨厚度（Ct.Th）增加。结论:PCSK9敲除后促进小鼠长骨发育,提高成年小鼠长骨骨小梁及皮质骨骨量。提示PCSK9参与骨代谢。第二部分:PCSK9敲除对BMSCs定向分化的研究研究目的:本部分研究目的为探索PCSK9敲除后对BMSCs成骨、成脂向分化过程的作用,并阐述其调控分化的机制。材料与方法:提取原代BMSCs,矿化诱导、成脂诱导、成软骨诱导检测其三向分化能力。q RT-PCR、ALP染色、茜素红染色、油红O染色检测PCSK9敲除对BMSCs成骨、成脂向分化能力的影响。m RNA-seq筛选PCSK9-/-及WT小鼠BMSCs中表达差异基因,q RT-PCR验证m RNA-seq结果。Western blot、双萤光素酶实验、q RT-PCR实验检测PCSK9敲除对Wnt/β-catenin通路的影响。实验结果:茜素红染色、油红O染色、阿尔辛兰染色显示原代BMSCs具有良好的成骨、成脂、成软骨向分化能力。PCSK9敲除后促进矿化诱导过程中ALP、RUNX2、OCN的表达,抑制成脂诱导过程中PPARγ、CEBPα以及adipo Q的表达。PCSK9敲除后促进BMSCs ALP活性及钙盐沉积,抑制脂滴的形成。m RNA-seq结果显示PCSK9敲除后抑制DKK1的表达,q RT-PCR验证此结果。Western blot、双萤光素酶实验、q RT-PCR显示PCSK9敲除后显著促进Wnt/β-catenin信号通路活性。结论:PCSK9敲除后促进BMSCs成骨向分化,抑制其成脂向分化,并且抑制DKK1的表达而提高Wnt/β-catenin通路活性。第三部分:PCSK9对破骨细胞分化的作用研究实验目的:此部分旨在探究PCSK9对单核巨噬细胞破骨向分化的影响及相关机制的研究。材料与方法:TRAP染色检测6～8周小鼠股骨切片破骨细胞的数量以及原代BMMs在M-CSF和RANKL诱导下破骨细胞的形成能力。利用慢病毒系统在RAW264.7细胞中过表达及干扰PCSK9,CCK8检测PCSK9对RAW264.7增殖能力的影响。TRAP染色检测PCSK9对BMMs及RAW264.7破骨向分化的影响。Western blot检测PCSK9对LDLR的调节作用。si LDLR及小檗碱检测PCSK9对破骨细胞分化影响的内在机制。实验结果:TRAP染色显示PCSK9敲除鼠股骨组织中破骨细胞数量增加,且PCSK9-/-BMMs在M-CSF和RANKL诱导下破骨形成数量增加。PCSK9敲除后,LDLR表达量增加,si RNA抑制LDLR表达后,PCSK9-/-BMMs破骨形成能力减弱。CCK8实验表明,PCSK9干扰或过表达对RAW264.7增殖无明显影响,但天然植物生物碱小檗碱在体外抑制PCSK9的m RNA表达,增强LDLR的表达,显著抑制细胞增殖。过表达或加入重组PCSK9蛋白后,RAW264.7破骨形成能力减弱,干扰PCSK9后RAW264.7破骨形成能力增强,si RNA抑制LDLR表达后,干扰PCSK9引起的RAW264.7破骨形成能力减弱。尽管小檗碱促进LDLR的表达,却强烈抑制破骨细胞形成。结论:PCSK9通过下调LDLR的表达抑制破骨细胞形成。第四部分:PCSK9敲除在小鼠根尖周炎骨丢失中的作用实验目的:此部分研究目的在于探究PCSK9敲除后对小鼠根尖周炎症反应及在根尖骨丢失中的作用。材料与方法:小鼠通过暴露单侧下颌第一磨牙牙髓21天构建根尖周炎模型,Micro-CT检测根尖周骨破坏阴影,HE染色检测根尖破坏程度及炎症浸润程度。q RT-PCR检测组织炎症因子IL-6及TNF-α的表达。体外LPS刺激BMMs,检测PCSK9的表达变化及PCSK9敲除对LPS诱导的BMMs免疫炎症反应。流式细胞术检测PCSK9敲除对BMMs M1、M2向极化的影响。TRAP染色检测PCSK9敲除对小鼠根尖周组织破骨细胞数量的影响,以及原代PCSK9-/-BMMs在LPS刺激后,在M-CSF和RANKL诱导下破骨细胞的形成能力。实验结果:Micro-CT分析显示牙髓暴露成功建立了小鼠根尖周炎模型,PCSK9-/-与WT小鼠牙髓非暴露侧根尖周间隙无明显差异,而暴露侧PCSK9-/-组根尖周骨组织破坏阴影明显高于WT组。HE染色结果可见PCSK9-/-组与WT组小鼠牙髓非暴露侧根尖周组织无炎症及骨质破坏,暴露侧PCSK9-/-组与WT组小鼠组均有炎细胞浸润,但PCSK9-/-组小鼠炎细胞浸润更明显,骨质破坏更严重。q RT-PCR结果显示暴露侧PCSK9-/-组与WT组小鼠根尖组织中IL-6和TNF-α的基因相对表达量均明显高于非暴露侧,PCSK9-/-组小鼠暴露侧与非暴露侧相比差异更显著。LPS刺激后,BMMs中PCSK9表达升高。PCSK9-/-BMMs在LPS刺激下炎症因子IL-6,TNF-α和IL-1β表达量升高,而PCSK9敲除对BMMs极化无明显影响。TRAP染色显示暴露侧PCSK9-/-组根尖周组织TRAP+细胞明显多于WT小鼠组。PCSK9-/-BMMs在LPS刺激后的破骨形成能力显著高于未加LPS刺激组。结论:PCSK9敲除后加重小鼠根尖周炎的炎症反应和骨质破坏。