狼毒作为有毒中药收载于中国药典2015版,具有毒-效双重性。药理学研究显示,狼毒具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫活性调节等作用。但因其安全范围窄且作用机理不明确,严重影响狼毒的临床应用。狼毒色原酮(CMC)、新狼毒素B(NCB)和新狼毒素A(NCA)是狼毒的主要活性成分。药物的吸收、分布、代谢、排泄对有毒中药作用机理的阐明、毒性和有效性的阐释、安全性的评价具有重要作用。本课题从体外和体内两个层面,采用人源化高表达药物转运体细胞模型、整体动物模型结合计算机分子对接模型,从蛋白-细胞-生物体多个层面系统研究了双黄酮类化合物CMC、NCB和NCA与药物转运体MRP2、BCRP、P-gp和OAT1之间的相互作用。通过细胞转运、积聚及其抑制实验,细胞动力学和药物代谢动力学研究等,阐明它们与药物转运体相互作用以及主要成分之间的药物药物相互作用的机理,为狼毒的深入开发和合理应用提供科学依据。1.LC-MS/MS分析方法的建立和验证建立了CMC、NCB、NCA(内标法)和拉米夫定(外标法)在三种基质(HBSS、 0.1% SDS细胞破碎液、大鼠血浆)中的LC-MS/MS分析方法,经过分析方法学验证,这些方法的专属性、线性范围、定量下限、精密度、准确度、基质效应和样品稳定性等均符合生物样本中药物分析方法的要求,同时可满足本实验需求,为本课题的研究提供了可靠的测定方法。2.三种双黄酮与人MRP2、BCRP、P-gp和OAT1相互作用的体外研究采用MDCK-MRP2、LLC-PK1-BCRP、MDCK-MDR1和MDCK-OAT1转基因细胞模型,研究了三种双黄酮的转运机制及其与上述四种药物转运体功能的影响。结果表明,NCB为MRP2、P-gp底物,CMC为MRP2、BCRP患物。NCA为BCRP藏物。CMC和NCB为MRP2、BCRP和P-gp抑制剂,NCA为MRP2抑制剂。三者均为OAT1的底物和抑制剂。另外,以NCB为代表性化合物,对其作为MRP2、BCRP、P-gp和OAT1的抑制剂进行了抑制机理的探讨。RT-qPCR和Western blot的分析表明,NCB抑制P-gp的mRNA和蛋白表达,抑制常数Ki大于KI,属于竞争性和非竞争性的混合抑制类型。相同的实验方法证实, NCB对MRP2的抑制为竞争性抑制类型,对OAT1的抑制类型是混合抑制类型。计算机分子对接模型研究表明,NCB作为一种双黄酮与单黄酮的结构相比,NCB的自由能更低,与P-gp的结合更具有化学结构上的对接优势,对P-gp的抑制更强。3.三种双黄酮基于转运体药物相互作用的体内研究(1)CMC单独给药及与NCB联合给药的大鼠药物代谢动力学研究对CMC单独给药(30mg/kg), CMC和NCB联合给药(30mg/kg CMC和15mg/kg NCB)进行了大鼠体内药物代谢动力学参数的比较。与CMC单独给药相比,CMC和NCB联合给药后CMC的AUC0-∞-和Cmax分别增加了48.9%和81.9%。而体外试验结果表明CMC是MRP2和BCRP的底物但不是P-gp的外排底物,因此,NCB对肠道外排转运体MRP2和BCRP的抑制作用是联合给药后CMC生物利用度提高的主要原因之一。(2)狼毒提取物与拉米夫定联合用药后的大鼠药物代谢动力学研究狼毒和拉米夫定都具有抗病毒的作用,且拉米夫定是OAT1的经典底物。拉米夫定与狼毒提取物联合给药后,拉米夫定AUC0-∞和Cmax均有大幅提高。体外试验结果显示CMC、NCB和NCA对MDCK-OAT1细胞中的拉米夫定摄取有显著的抑制作用,因此,推断其机理是狼毒提取物中的主要成分通过抑制肾脏摄取转运体OAT1从而增加拉米夫定的血药浓度。(3)狼毒提取物的药物代谢动力学研究尽管CMC的含量在提取物中最高,但是大鼠234.5 mg/kg狼毒提取物(按百分含量折算,CMC、NCB和NCA的大鼠口服剂量分别为66.8mg/kg,34.5 mg/kg和33.3mg/kg)口服给药后,CMC吸收的绝对数量却不如NCB,三者AUC0-∞经给药剂量校正后的相对比率分别为1.0,4.2,0.3；Cmax经剂量校正后相对比率分别为1.0,5.2,0.4显示NCB在三者中的吸收最好,NCA最差。综上,与单个成分比较,狼毒提取物中CMC、NCB和NCA等多个成分之间可与药物转运体发生相互作用,而导致各自ADME性质的改变,提示狼毒提取物及其活性成分的体内处置是一个复杂的过程。