四氢嘧啶（Ectoine）作为一种相容性溶质,具有调节细胞渗透压,极端条件下维持大分子物质（蛋白质、酶、核酸等）和细胞膜结构与功能稳定等的作用,目前已广泛应用于医疗,化妆品,环境修复,酶工业等多个领域。嗜盐、耐盐菌中,四氢嘧啶的生产依赖高盐浓度的诱导,因此产量低且提取困难。为满足日益增长的工业需求,人们开始关注四氢嘧啶的化学合成法与生物合成法。四氢嘧啶的手性结构等问题,导致化学合成四氢嘧啶的难度与成本增加。与之相比,生物合成技术具有工艺简单,环保等多种优势。基于此,本研究在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达了来源于伸长盐单胞菌（Halomonas elongata ATCC 33173）的四氢嘧啶合成基因簇ect ABC,通过表达宿主与表达系统的比较,核糖体结合位点（RBS）优化策略,前体强化菌株的构建与转录后水平抑制支路途径基因等策略构建重组工程菌株发酵合成四氢嘧啶。本研究的主要结果如下:（1）比较表达宿主与表达系统。通过比较E.coli W3110,E.coli BL21（DE3）,E.coli DH5α和高产天冬氨酸的大肠杆菌（命名为E.coli（asp））四个不同的表达宿主发现,在以E.coli BL 21（DE3）为宿主时四氢嘧啶产量最高(185.2 mg·L-1);在此基础上比较了p BBR1MCS-2,p RSFDuet-1和p CDFDuet-1这三个具有不同拷贝数的表达系统,发现以高拷贝的p RSFDuet-1为载体时四氢嘧啶产量最高(267.3 mg·L-1),最终确定以E.coli BL21（DE3）为表达宿主,p RSFDuet-1为表达载体,将菌株E/p R-ABC作为出发菌株。（2）基于RBS序列优化策略强化四氢嘧啶合成。首次采用RBS序列优化策略,对E/p R-ABC中的异源基因ect A,ect B和ect C的RBS序列进行改造,构建RBS改造工程菌。结果表明,对ect A和ect B同时进行RBS序列优化的菌株ECT-AB四氢嘧啶产量提高最多,达521.2 mg·L-1,其单位菌体产量为52.4 mg·(L·OD600)-1,分别比E/p R-ABC提高72.6%和72.4%。结合SDS-PAGE分析,推测EctA和EctB是四氢嘧啶生产限速酶。（3）四氢嘧啶合成途径基因的强化。为强化前体物质L-天冬氨酸或L-天冬氨酸β-半醛的供给,过量表达了天冬氨酸激酶（Lys C）、天冬氨酸半醛脱氢酶（Asd）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PPC）、天冬氨酸转氨酶（Asp C）和天冬氨酸裂解酶（Asp A）,发现单独强化Lys C时更有利于四氢嘧啶的合成。ECT-AB-L的四氢嘧啶最高产量为551.2 mg·L-1,单位菌体产量为68.4 mg·(L·OD600)-1,分别比ECT-AB提高了5.7%和5.0%。（4）转录后水平抑制支路途径基因。采用sRNA技术对支路途径的关键基因pts G,pta,thr A和lys A进行了不同程度的单基因抑制与不同基因组合的多基因抑制。摇瓶验证结果表明,同时抑制基因pts G和thr A的菌株ECT-AB-L-p Gt产四氢嘧啶量最高,达到了2166.9 mg·L-1,比对照菌ECT-AB-L提高了286.1%;同时抑制基因pts G,thr A和lys A的菌株ECT-AB-L-p Gtl单位菌体产量最高,达到了206.2 mg·(L·OD600)-1,比ECT-AB-L提高了251.4%。