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天然橡胶因为其优良的特性,被广泛用于工业、国防、交通、民生、医药、卫生等领域,是一种重要的工业原料和战略资源,然而橡胶树病害的发生严重影响了天然橡胶的产量。因此,如何找出一条合适的途径来有效的解决橡胶树病害,减少天然橡胶的损失,意义重大。现阶段,由于橡胶树遗传转化体系的不成熟,很大程度上限制了橡胶树功能基因组学工作的深入开展,导致橡胶树分子病理学研究的严重滞后。目前橡胶树病害防治方法主要以化学防治为主,成本高、污染大,容易产生抗药性,需要建立新的橡胶树病害防治策略。随着生物技术被广泛利用,人们提出了橡胶树基因工程抗病育种的新思路。基于此,本研究以巴西橡胶树7-33-97品种为试验材料,利用橡胶树叶片原生质体瞬时表达系统,建立了橡胶树先天免疫反应的检测体系,为橡胶树病理学研究提供技术基础。同时,为了筛选有效的橡胶树抗病关键基因用于抗病基因工程育种,我们利用基于转录组的基因差异表达分析方法,对其中的钙依赖型蛋白激酶（calcium-dependentprotein kinase,CDPK）基因家族进行了克隆和功能分析,主要实验结果如下:1.利用原生质体瞬时表达系统研究橡胶树先天免疫反应的结果:（1）通过半定量（RT-PCR）技术和双荧光素酶报告系统检测发现,植物先天免疫反应诱导物flg22和chitin能够改变橡胶树防卫反应相关基因的表达:flg22处理后,HbPR1、HbPR5基因表达明显上调;chitin处理后,HbPR5基因表达明显上调,HbPR1基因表达无变化,而两种PAMPs处理后对HbMAPK3和HbMAPK6基因表达并无影响。这些结果说明HbPR1、HbPR5基因参与了橡胶树PTI免疫途径,但参与的具体信号途径并不相同。（2）flg22和chitin影响橡胶树体细胞中MAPKs的活性激活:flg22能诱导橡胶树细胞内MAPK发生自我磷酸化,但没有检测到chitin对橡胶树细胞内MAPKs自我磷酸化。说明flg22能够通过自我磷酸化作用激活MAPKs的活性。（3）flg22和chitin均能引起橡胶树原生质体细胞内活性氧的积累。（4）flg22和chitin对橡胶树抗氧化酶系统的影响:flg22和chitin均能诱导细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）以及过氧化氢酶（CAT）活性的升高。说明这三种抗氧化酶参与了橡胶树的PTI反应。2.转录组差异基因表达分析筛选橡胶树抗病相关基因的结果:通过RNA-seq技术对SA处理前后橡胶树叶片中基因差异表达谱进行了分析。整体来看,在组装获得的44477个Unigenes中,SA处理能够诱导8125个Unigene的表达发生显著变化,其中上调表达的基因比下调基因要多。此外,为了了解这些差异表达基因（DEGs）的可能生物学功能,我们依据KEGG数据库对这些基因进行了Pathway显著性富集分析。结果显示,在前10个显著富集的pathway中,与植物抗病性直接相关的有次生代谢生物合成途径（biosynthesis of secondary metabolites）,植物激素信号转导途径（plant hormone signal transduction）和植物-病原互作途径（plant-pathogen interaction）。进一步对植物-病原互作途径进行分析,发现相应的DEGs主要参与以下抗病相关反应:（1）与ROS的产生调控的组分,包括上调的APX,CDPKs,CaMCML,NOS和下调的NADPH氧化酶等。（2）参与PTI信号传递途径的组分,包括FLS2,BAK1,MEKK1,MKK1/2,MEKK4/5,WRKY35/33,WRKY22/29等,这些基因均为上调表达,表明SA处理激活了植物的PTI。（3）参与ETI信号传递途径的组分,包括RPM1,RPS2,PBS1,RPS5,MIN7,JAZ等。根据以上分析结果,我们选取了 CDPK基因家族作为进一步研究的候选基因。3.橡胶树CDPK基因家族的克隆和表达分析结果:（1）本研究通过生物信息学分析获得了 31个橡胶树CDPK基因家族成员,分别命名为HbCDPK1-31,其中获得克隆的有28个,HbCDPK19、HbCDPK21和HbCDPK30未能扩增出cDNA全长。（2）将测序正确的28个HbCDPK基因进行进化树分析发现,HbCDPK基因家族可分为四个 Subgroups,我们将HbCDPK5、9、10、15、17、20、22、27、28、31统一划分为 Subgroup Ⅰ,HbCDPK1、6、8、11、12、14、16、23 统一划分为 SubgroupⅡ,HbCDPK2、3、4、7、13、18、24、26、29统一划分为 Subgroup Ⅲ,而 SubgroupⅣ只包含HbCDPK25。（3）不同病原菌（炭疽病菌和白粉病菌）接种橡胶树叶片后,利用qPCR技术检测HbCDPK基因家族的应答反应,数据表明,炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）接种后,HbCDPK1、4、8、13、11、15、18、20、29 表达上调,HbCDPK6、13、24表达下调,其余基因的表达量无明显变化;而在白粉病菌（Odium heveae Steinm）接种后,HbCDPK2、3、6、7、10、14、22、23、26 表达上调,HbCDPK18、29表达下调,其余基因的表达量无明显变化。（4）不同激素信号分子（SA、JA、ET、ABA、GA）刺激处理橡胶树叶片后,利用qPCR技术检测HbCDPK基因家族的应答反应,数据表明,在对SA的应答中,HbCDPK1、2、7、9、15、20、23、26、28、31 表达上调 HbCDPK4、14、24、29表达有所下调,而其余基因表达量无明显变化;在对JA的应答中,HbCDPK1、6、8、12、15、18、23、27、29表达上调,HbCDPK2、10、17、25表达下调,其余基因表达量无明显变化;在对ET的应答中,HbCDPK24表达上调,而HbCDPK25在6h表达上调随后表达明显下调,其余基因表达量无明显变化;在对ABA的应答中,HbCDPK3、5、8、12、16、18、20、22表达上调,HbCDPK14、25、31 表达下调,其余基因表达量无明显变化;在对GA的应答中,HbCDPK10、14、17、20、27表达上调,HbCDPK3、24表达下调,其余基因表达量无明显变化。这些结果说明橡胶树不同的CDPK基因家族成员可能通过不同的信号转导途径去发挥不同的作用,但不同成员之间存在信号转导的交叉和重叠。（5）利用橡胶树原生质体瞬时表达系统对已经获得克隆的28个HbCDPK蛋白进行了亚细胞定位分析,通过激光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位情况,结果显示,HbCDPK1、6、8、9、12、16、18、23、25、27 蛋白定位于细胞膜上;HbCDPK2、3、4、5、7、10、11、13、14、15、17、20、22、24、26、28、29、31 蛋白定位于细胞质或细胞器中,但具体是定位于哪一细胞组分还需进一步鉴定。（6）利用橡胶树原生质体瞬时表达系统检测了 28个HbCDPK基因过表达后原生质体细胞内活性氧的积累情况,结果表明,HbCDPK3、8、9、10、15、18、20、23、26、29的表达能够明显引起引起橡胶树细胞内活性氧的积累。4.HbCDPK1 的功能分析结果:（1）测序结果表明,HbCDPK15基因编码区长度为1686bp,是一个完整性的开放性阅读框,编码561个氨基酸的多肽。HbCDPK15蛋白分子量为62.8 KD,等电点为5.62,含有STKcCAMK结构域和四个EF-hand钙离子结合结构域。通过同源性比对发现HbCDPK15与拟南芥中AtCPK6的同源性最高。（2）为了了解HbCDPK15的生物学功能,我们构建了HbCDPK15转拟南芥cpk6突变体的植株35s:HbCDPK15/cpk6。通过灰霉病菌（Botrytiscinerea）、链格孢菌（Alternaria alternata）以及Pseudomonou springae vs tomato.DC3000 接种实验,我们发现,拟南芥cpk6对灰霉菌的抗性明显低于野生型Col-0和35s:HbCDPK15/cpk6对灰霉菌的抗性与Co1-0相当,说明HbCDPK15能够互补拟南芥CPK6在对灰霉病菌抗性中的作用。三者对链格孢菌（Alternaria altenata）和Pseudomonous springae vs tomato.DC3000的抗性无明显差异。同时我们发现,在盐胁迫下,35s:HbCDPK15/cpk6的种子萌发率与Col-0相当,但明显高于cpk6植株的种子,三者的幼苗根长无明显区别,说明HbCDPK15可能只参与了盐胁迫下种子的萌发过程,并与盐胁迫下植株的生长关系不大;ABA处理和低温胁迫下,Col-0,cpk6 和35s:HbCDPK15/cpk6的萌发和幼苗生长没有表现明显差异,说明HbCDPK15与ABA和低温胁迫没有明显相关性,这与ABA处理下HbCDPK15的表达模式一致。（3）Co-IP实验结果表明,HbCDPK15可以与HbRboh D发生互作,说明HbCDPK15可能通过激活HbRboh D来促进细胞内活性氧的积累。