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葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)有着重要的生理作用,它是糖原分解的第一个产物,可转化为葡萄糖-6-磷酸,进入EMP途径；也可与UTP反应生成UDP-葡萄糖,并进一步合成各种糖苷键。应用方面,G-1-P能阻止脂肪肝浸润,促进骨骼及牙齿中钙的累积；其铂螯合物更可用于癌症的治疗。G-1-P的生产主要是蔗糖磷酸化酶(SPase)催化蔗糖合成及葡聚糖磷酸化酶(GPase)催化可溶性淀粉合成。两者各有优缺点,就蔗糖而言,SPase是常温酶,较难工业化应用,且蔗糖中一半的碳原子转化为果糖,造成碳原子不完全利用。就可溶性淀粉而言,原料生产工艺繁琐。且两种底物价格均较高。理论上,GPase可以利用普通淀粉为原料,但是普通淀粉在常温下不能糊化,很难利用。而高温GPase催化淀粉原粉很好地解决了上述问题,成为合成G-1-P的理想方法。本文工作以提高G-1-P产量及降低原料成本为出发点,将嗜热菌Pyrococcus furiosus中编码GPase的基因在E. coli中重组表达,通过条件及反应过程优化,利用重组GPase在高温下催化普通淀粉产G-1-P。将嗜热古生菌Pyrococcus furiosus (DSM 3638)中编码葡聚糖磷酸化酶的基因根据已报道的序列(GenBank:1469411)对其中相对E. coli的稀有密码子序列进行优化,将优化后的基因序列进行全合成。将全合成基因连接到pET-28a(+)质粒上,构建重组质粒pET-28a-GP,转化到E.coli BL21(DE3)中,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-GP,诱导表达重组葡聚糖磷酸化酶,最优诱导条件为：当培养4h时,用0.2 mM IPTG诱导,诱导后28℃培养8h。利用重组GPase的耐热性,对粗酶液高温保温处理,以此对GPase进行纯化。得到GPase纯酶的比酶活为120.57U/mg,酶活回收率为85.31%。对催化条件进行优化,得最适催化条件为：80℃、pH 6.6、5%淀粉/1 M磷酸盐缓冲液。考察GPase对不同淀粉的催化能力,结果表明,在80℃条件下,其对普通淀粉的转化率与可溶性淀粉相似(59%)。通过对反应过程优化,包括反应液预处理、高浓度底物催化及补料催化,最终以7.5%玉米淀粉为底物,反应16h补入2.5%玉米淀粉+0.2 M磷酸盐缓冲液,继续反应32 h,最终G-1-P产量达259.87 mM,转化率达67.60%,高于与相同浓度的可溶性淀粉为底物的体系(252.9 mM,65.9%)。目前在GPase催化生产G-1-P的研究中,Jungdon等人以可溶性淀粉为底物,70℃条件下生产G-1-P,转化率为68.78%,这是目前报道的最高值。而本实验以淀粉原粉为底物,80℃下制备G-1-P,转化率达67.60%,与文献报道相近,但是原料成本远低于文献报道。本文首次尝试利用重组GPase催化廉价易得的普通淀粉生产G-1-P,通过反应过程优化,提高G-1-P产量,与可溶性淀粉为底物相比,产量接近。表明淀粉可以替代可溶性淀粉为底物生产G-1-P,降低原料成本,同时建立了G-1-P的简单稳定的分离方法,为G-1-P的工业化生产奠定了基础。