鼠疫耶尔森氏菌密度感应系统研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 3次 | 上传用户:jankhxin
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目的:鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌)是一种烈性病原体,通过蚤的叮咬可以引发宿主动物间以及人间的鼠疫爆发流行,了解鼠疫菌的致病机制才能够有效的防治鼠疫的爆发流行。密度感应(quorum sensing,QS)系统是一种细胞密度依赖的胞间信号传递系统,通过这种机制菌群可以同步调动大量基因的表达,体现出有组织的类似于多细胞生物的群体性行为。根据其他细菌QS系统的研究结果,该系统可能与鼠疫菌的致病机制相关,因而对于鼠疫菌的QS系统进行研究将有助于对该菌致病机制的理解。方法:[1]QS系统信号分子检测鉴定:利用QS系统Ⅰ型信号分子报告菌根癌农杆菌NTL4(pZLR4)(Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4))与Ⅱ型信号分子报告菌哈氏弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170)对鼠疫菌是否产生信号分子进行定性检测,进而利用HPLC-MS-MS对鼠疫菌培养上清中存在的Ⅰ型信号分子进行鉴定,并确定鼠疫菌Ⅰ型QS系统内部存在的两种信号分子合成酶各自对应的合成产物;[2]QS系统效期范围与内调控分析:从宏观角度,利用报告菌NTL4与BB170,对鼠疫菌野生株及QS系统系列突变株Ⅰ型信号分子与Ⅱ型信号分子的生成规律进行分析,从而明确Ⅰ型与Ⅱ型QS系统的效期范围与相关性,同时预测Ⅰ型内部两套调控元之间的内调控关系;[3]Ⅰ型QS系统与多细胞性的相关性:从表型方面,对鼠疫菌野生株与QS系统系列突变株在LB富养培养基与TMH贫养培养基中的多细胞性(multicellularity)形成状态与生成量进行系统分析,从而对Ⅰ型系统内部两套调控元与多细胞性形成的相关性进行分析;[4]Ⅰ型QS系统比较蛋白质组分析:从微观角度,使用双向电泳技术,对鼠疫菌Ⅰ型QS系统进行比较蛋白质组分析,揭示Ⅰ型QS系统与鼠疫菌在高密度条件下存活与毒力的相关性。结果:[1]QS系统信号分子检测鉴定:定性检测的结果与基因预测一致,鼠疫菌中同时存在Ⅰ型与Ⅱ型QS系统,经HPLC-MS-MS鉴定,鼠疫菌所合成的Ⅰ型信号分子共有四种,即C6-HSL,C8-HSL,3-oxo-C6-HSL,3-oxo-C8-HSL,其中信号分子合成酶YpeⅠ负责合成3-oxo-C6-HSL,信号分子合成酶YspⅠ负责合成C6-HSL,C8-HSL,3-oxo-C6-HSL,3-oxo-C8-HSL,此外没有其它的Ⅰ型信号分子合成酶存在;[2]QS系统效期范围与内调控分析:经报告菌的半定量分析,鼠疫菌Ⅰ型信号分子的效期范围是从对数前期直至静止晚期,其顶峰出现在进入静止期后约2-3h,并持续约10h才会逐渐减弱;鼠疫菌Ⅱ型信号分子的效期范围是从对数前期至静止期,其顶峰出现在对数中晚期,在静止期到来之前彻底消失;鼠疫菌的自身生长状态实现了其在不同时期对于Ⅰ型QS系统与Ⅱ型QS系统的选择;此外,经分析预测在鼠疫菌Ⅰ型QS系统内部存在自调控现象,即ypeⅠ/ypeR与yspⅠ/yspR两套调控元内部均存在负调控回路,与此同时ypeⅠ/ypeR调控元在功能上位于上游,对yspⅠ/yspR调控元具有负调控作用;[3]Ⅰ型QS系统与多细胞性的相关性:经过对鼠疫菌多细胞性的形成状态与生成量的表型分析,发现QS系统与多细胞性的形成直接相关,ypeⅠ/ypeR调控元的控制发挥着决定作用;[4]QS系统比较蛋白质组分析:经比较蛋白质组学分析,Ⅰ型QS系统对于鼠疫菌的自我保护、能源运输、能量代谢具有明显的上调控作用,并以此增强鼠疫菌在静止期高密度状态下的生存能力,可能由此间接提高了鼠疫菌的毒力,而未发现对鼠疫菌已知毒力因子的显著上调作用。结论:对鼠疫菌QS系统进行了检测、鉴定、作用规律分析与内调控分析;并利用表型分析对该系统的内调控规律予以补充;在此基础上,最终利用比较蛋白质组学对Ⅰ型QS系统的调控功能进行了分析;结果显示,Ⅰ型QS系统对于鼠疫菌的自我保护、能源运输、能量代谢具有明显的上调控作用,并以此增强鼠疫菌在高密度状态下的生存能力,可能间接提高鼠疫菌的毒力,而未发现对鼠疫菌已知毒力因子的显著上调作用。
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