【摘 要】
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锯缘青蟹Scylla serrata (Forsk?l,1775)是我国最重要的海水养殖经济蟹类之一。本论文运用液相色谱技术分离纯化获得一种新抗菌肽,命名为Scygonadin,利用分子生物学技术克隆
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锯缘青蟹Scylla serrata (Forsk?l,1775)是我国最重要的海水养殖经济蟹类之一。本论文运用液相色谱技术分离纯化获得一种新抗菌肽,命名为Scygonadin,利用分子生物学技术克隆获得Scygonadin全长基因序列,利用生物信息学的方法阐明其基因结构,运用分子生物学的方法分析该基因在锯缘青蟹体内各组织器官中的转录表达情况等,为阐明锯缘青蟹的先天性免疫及生殖免疫机制奠定基础。通过研究获得了如下结果:1、分离纯化获得一种新抗菌肽。以锯缘青蟹的精液为材料,通过酸性溶液萃取,联合利用阳离子交换层析和反相高效液相层析技术进行分离纯化,获得一种单成份,Tricine-SDS-PAGE测定其分子量约为10.8 kDa。胰蛋白酶裂解该多肽后,用MALDI-ToF-MS法分析了肽指纹图谱。Edman降解法测定其N-端20个氨基序列为H-GQALNKLMPKIVSAIIYMVG-OH,BLAST进行数据库检索,发现与已知抗菌肽的同源性很低,是一种新的抗菌肽,由于从Scylla serrata的雄性生殖腺中获得,具有抗菌活性,故命名为Scygonadin。2、克隆获得Scygonadin全长cDNA序列。利用简并反转录-聚合酶链式反应(Degenerated RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆获得了Scygonadin全长cDNA序列,并登录GenBank数据库,登录号:AY864802。Scygonadin cDNA全长539 bp (不包括poly A),其中5’非翻译区56 bp、蛋白质编码区381 bp(包括终止密码子TAA)和3’非翻译区102 bp。3’非翻译区包括保守的信号序列(AATAAA),其后紧接着16个非腺苷酸序列和多聚腺苷酸序列。推导的全长氨基酸含有126个氨基酸残基,由信号肽(24个氨基酸残基)和成熟肽(102个氨基酸)两部分组成。成熟肽平均分子量为11271.82 Da,pI为6.09,为阴离子抗菌肽。在甲壳动物中尚未见阴离子抗菌肽的报道。
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