核酸分子探针作为近年来发展起来的新型生物分析工具,主要是以核酸序列作为基本组成单元,以碱基配对及其他作用方式作为识别动力,最终以光、电等信号将探针与目标物质的相互作用输出出来。核酸分子探针已经成功应用于生物小分子、核酸、蛋白质及肿瘤细胞的检测中。然而,传统的核酸分子探针与目标物主要是基于1：1结合比率下实现分子识别及信号转换,因此在针对不同目标物的生物分析中通常需要合成多种荧光或者其他信号报告分子功能化的核酸探针,这在一定程度上将会增加实验繁琐程度,提高实验成本。此外,这种1：1的信号转换方式也会将核酸探针的检测灵敏度限制在一定范围之内。因此,核酸探针的通用性及高灵敏检测仍然是科研工作者面临的重要挑战。为了解决这些问题,本论文结合核酸工具酶、利用主客体间相互作用,同时结合三链分子开关、DNA杂交链式反应等构建了一系列通用型核酸传感平台,实现了目标DNA、生物小分子及细胞的放大检测,并将其进一步扩展至肿瘤细胞的靶向治疗中。主要开展了以下几方面的工作：一、基于链置换反应设计构象可转换的核酸探针用于单碱基多态性的检测主要以链置换放大反应为基础,设计了一种包含有发夹I和发夹II两部分构象可转换核酸探针。在目标序列不存在时,探针呈发夹构象I,此时结构II的茎部互补序列部分被包含在结构I的茎部内,3’端为延长的单链DNA序列。由于缺少聚合反应的引物因此不能发生聚合反应。加入目标序列之后,发夹I被打开,II的茎部被释放出来重新形成发夹结构并且3’端杂交成双链充当聚合反应的引物。经过反复多次的聚合置换即可以实现目标序列的高灵敏检测。二、基于主客体作用设计茎部性能可控的核酸探针用于目标物的放大检测在分子信标两末端分别标记芘分子,通过向反应体系中加入环糊精实现分子信标热稳定性的调控及目标物的信号放大检测。芘分子与环糊精的包络作用可以增加溶液中芘单体分子形成二聚体的机率,进而调控分子信标茎部的稳定性,另外环糊精空腔内的疏水性环境也可以有效的增强芘分子二聚体荧光。当向反应体系中加入待检测物后,待检测物与探针作用破坏其分子信标构象,此时末端的芘分子脱离环糊精空腔,二聚体荧光降低,单体荧光上升,通过对整个过程中单体与二聚体荧光信号转换的监测可以实现生物分子的高灵敏检测。三、基于DNA三链分子开关构建荧光核酸检测平台实现多目标物的检测(1)结合稳态荧光检测技术实现溶液体系中多目标物的检测。选择末端分别标记芘的分子信标作为信号报告探针,同时在核酸适体末端延长T、C碱基作为捕获探针,信号报告探针与捕获探针在合适的pH条件下形成DNA三链分子开关结构,此时信号探针两端标记的芘分子相互远离,核酸适体序列暴露在外面进行目标物的识别。加入目标物后,目标物与核酸适体作用,破坏三链结构,释放出信号报告探针。通过监测芘分子稳态荧光的信号变化实现目标物的定量检测。另外,在不同目标物存在时,只需要改变核酸适体序列即可实现多组份分析,检测体系成本低,通用性好。(2)结合时间分辨荧光技术实现复杂体系中汞离子(Hg2+)的检测。首先在磁纳米颗粒表面构建三链分子开关,以富T的DNA序列作为Hg2+识别单元,双芘标记的分子信标作为信号报告探针。在Hg2+存在下,三链结构破坏,捕获探针与信号报告探针分离,释放出的信号探针形成双链分子信标,其两端标记的芘分子靠近形成二聚体荧光。Hg2+与捕获探针结合后通过磁分离可以进一步避免Hg2+对芘二聚体荧光的淬灭作用,因此利用时间分辨荧光技术作为信号输出手段可以实现复杂体系中Hg2+的检测。四、基于DNA三链分子开关构建表面增强拉曼核酸检测平台实现目标物的放大检测(1)结合前面提出的DNA三链分子开关,利用生物分子与核酸适体特异性结合引起银纳米颗粒与金膜基底之间的距离变化,从而导致拉曼“热点”效应的产生,由此实现银纳米颗粒表面功能化的拉曼报告分子的信号增强。同时,当向体系中加入三链分子开关的捕获探针时,银纳米颗粒与金膜基底的距离变大,促使拉曼增强信号减弱,整个过程可以实现生物分子的高灵敏检测及拉曼活性基底的循环再生利用。(2)如前几章所述构建三链分子开关作为分子识别部分,在目标物存在下,三链分子开关被打开释放出信号报告探针引发DNA杂交链式反应。由于杂交链式反应形成的长链DNA上修饰有很多巯基基团,当向其中加入拉曼信号分子功能化的金纳米颗粒后,大量金纳米颗粒通过“金-巯”键作用连接至长链DNA上并呈聚集状态。此时,相邻金纳米颗粒之间的“热点”作用大大加强,其表面功能化的拉曼信号分子产生局部磁场引起化学键的振动,从而产生很强的拉曼信号。因此可以实现多目标物的拉曼放大检测。五、基于DNA杂交链式反应构建功能小分子的高效核酸探针输送平台将杂交链式反应的引发剂功能化至纳米颗粒表面通过杂交链式反应自组装形成纳米颗粒球形核酸聚合物,从而实现生物功能分子的高效输送。首先以金纳米颗粒为模型构建尺寸可调控的球形核酸聚合物,接下来在杂交链式反应单体上修饰核酸适体及其他荧光基团实现肿瘤药物的高效装载及靶向运输,从而实现肿瘤细胞成像及治疗的目的。本论文为发展新的核酸探针信号转换策略提供了新的设计理念以及新的识别机理,为实现对目标物的高灵敏检测提供了指导思想。