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目的:乙型肝炎病毒相关性肾炎(Hepatitis B virus-related glomerulonephritis,HBV-GN)发生机制不清,尚缺乏有效手段延缓其进展。我国是慢性乙型肝炎发病率较高的国家,HBV-GN已成为我国主要的继发性肾脏病之一。近年来研究证实,HBV感染可直接引起肾小管上皮细胞损伤、小管间质炎症细胞浸润,最终进展为肾小管间质纤维化,但具体机制仍不清楚。赖氨酸特异性去甲基化酶1(Lysine-specific demethylase 1,LSD1)是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶,能够特异性脱去单甲基化和二甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4me1/2)和H3K9me1/2位点上的甲基基团,从而调节靶基因的转录活性。研究发现,LSD1通过介导上述组蛋白去甲基化调控免疫及炎症相关基因的表达,参与免疫、炎症反应。本研究旨在通过体内、外实验,观察LSD1在HBV诱导的肾小管间质炎症形成中的作用,并探讨可能的作用机制。方法:(1)收集2015年01月~2017年12月在上海交通大学附属第一人民医院等3家三甲医院经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为HBV-GN患者53例,既往无其它肾脏病史,以35例单纯血清HBV阳性原发性肾小球肾炎(Primary glomerulonephritis,PGN)患者、50例血清HBV阴性PGN患者肾组织以及15例肾肿瘤患者癌旁正常肾组织做为对照组。采用免疫荧光双标检测肾组织HBsAg与LSD1共表达;免疫组化检测肾组织炎症标志物、LSD1表达,并分析二者之间的关系。(2)用含1.3倍全长HBV基因组的质粒(pCMV-HBV-1.3)转染人近端肾小管上皮细胞(HK-2),建立HBV感染细胞模型。采用Realtime RT-PCR及ELISA检测促炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1表达和分泌;Realtime RT-PCR及Western blot检测LSD1表达。构建pcDNA3.1-myc-LSD1及LSD1shRNA质粒,转染上述细胞模型,采用Realtime RT-PCR及ELISA检测上述促炎症介质表达和分泌。(3)采用RNA-seq检测LSD1沉默前后差异表达的基因;Western blot检测LSD1沉默前后H3K4me1/2、H3K9me1/2、TLR4表达;染色质免疫共沉淀(ChIP)检测各组HK-2细胞中TLR4基因启动子上LSD1、H3K4me1/2、H3K9me1/2表达。构建pcDNA3.1-myc-TLR4及TLR4 shRNA质粒,与LSD1shRNA质粒共转染HBV感染的HK-2细胞。采用ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1分泌;Western blot检测HK-2细胞TLR4下游NF-κB和MAPK信号通路活化情况。经NF-κΒ和MAPK抑制剂干预后,检测上述促炎症介质分泌。结果:(1)与对照组相比,HBV-GN患者肾小管间质CD4~+T细胞及巨噬细胞浸润明显,且肾小管上皮细胞IL-1β、IL-6、MCP-1及LSD1表达上调。在LSD1的分布区域可见有HBsAg分布,LSD1的表达强度与HBsAg的强度相近。进一步研究发现,HBV-GN患者LSD1表达程度与肾小管及间质病变程度相关,与间质炎性细胞浸润、肾小管萎缩及肾间质纤维化最为密切。(2)转染HBV基因组的HK-2细胞培养上清中可见HBV DNA、HBsAg以及HBeAg表达,提示HBV感染HK-2细胞模型构建成功。HBV感染后,HK-2细胞IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1表达和分泌均增加,且LSD1表达上调。经LSD1过表达或沉默干预后,HK-2细胞IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1表达和分泌均相应增加或减少。(3)RNA-seq分析发现,LSD1沉默后共有983个基因显示其丰度增加超过1.5倍(表达上调),而557个基因则显示其丰度下降超过1.5倍(表达下调),并且上述许多基因参与了炎症反应过程。此外,在表达差异最大的上述基因中,许多著名基因也都与炎症有关,例如TLR4、IL-1β、TNFAIP3及SOCS2等。进一步研究发现,LSD1不能结合到IL-1β和IL-6基因启动子上直接调控它们表达;而LSD1能结合到TLR4基因启动子上介导H3K9me1/2而非H3K4me1/2去甲基化,进而直接调控其表达;沉默TLR4可抑制HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌,且过表达TLR4可恢复LSD1沉默诱导的促炎症介质分泌减少;沉默LSD1可抑制HBV诱导的IKKα/β、IκBα、JNK1/2、ERK1/2及p38MAPK蛋白磷酸化,而过表达TLR4可恢复上述蛋白磷酸化。NF-κB或JNK抑制剂能够抑制HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌。结论:(1)HBV-GN患者肾组织(主要是肾小管)中LSD1表达上调,且其表达程度与肾小管及间质炎症损伤密切相关,提示LSD1可能与HBV-GN肾间质炎症反应有关。(2)HBV感染HK-2细胞模型构建成功;HBV可诱导HK-2细胞促炎症介质分泌以及LSD1表达上调;过表达/沉默LSD1可促进/抑制HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌,这一过程可能依赖LSD1的组蛋白去甲基化作用。(3)RNA-seq分析发现TLR4是LSD1的下游靶基因;LSD1可直接结合到TLR4基因启动子上介导H3K9me1/2去甲基化,进而调控其表达;LSD1遂通过直接调控TLR4的表达介导NF-κB和JNK通路活化,从而促进HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌。