人参（Panax ginseng C.A Maye）为五加科人参属植物,是我国的传统名贵中药。人参皂甙是人参的有效成分,到目前为止,已经从人参中发现40多种人参皂甙。各种人参皂甙的含量不同,结构多样,药理活性也有很大的差别。研究发现某些在人参中含量很低的稀有人参皂甙具有很高的药用价值和应用前景。但是,稀有人参皂甙含量太低,很难从人参中直接提取,依靠目前的化学合成技术也难以工业生产。制备这些稀有人参皂甙唯一可行的方法是改变某些高含量人参皂甙的化学结构来完成。化学转化法通常选择性较差,产率较低,同时容易造成环境污染。生物转化则具备条件温和、选择性较好、副产物少、得率高、无污染和容易工业化生产等优点,被认为是制备稀有人参皂甙最具有潜力的方法。本论文通过筛选发现,番茄褐孢霉产生的高选择性糖苷水解酶能将人参中含量最高的人参皂甙Rb₁水解为唯一产物——稀有人参皂甙Rd。本文探索了这种β-葡萄糖苷酶的分离纯化条件,研究了它的分子特征和性质,为工业应用奠定了基础。本论文的主要结果如下:1、从40种植物病原真菌中筛选出七种能够不同程度地转化人参皂甙的真菌,各种真菌的转化底物和产物不同。其中番茄褐孢霉能够特异性转化人参皂甙Rb₁成为Rd。最佳转化条件为:加底物时间,24 h;底物浓度,0.25 mg/ml;培养液pH值,pH5-6;培养时间,8 d;培养温度,37℃。番茄褐孢霉产生转化人参皂甙Rb₁成为Rd的糖苷酶的最佳产酶条件为:V8汁培养基,液体培养84小时。2、培养84 h的番茄褐孢霉V8汁培养液经过过滤离心、DEAE-cellulose阴离子交换柱层析、硫酸铵沉淀、Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析以及Mono Q阴离子交换柱层析等多步分离技术结合,成功分离纯化出一种电泳纯的β-葡萄糖苷酶G-I（人参皂甙Rb₁转化酶G-I）。G-I的纯化工艺具有很高的稳定性,能够保证其稳定制备。每50升番茄褐孢霉培养液约可获得0.5 mg活性蛋白,回收率为9%,比活力达17563 U/mg。3、Superose 6 10/300 GL凝胶过滤柱层析分析（HPLC）显示G-I的洗脱曲线为对称峰,分子量为80 KDa;经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）检测,图谱均显示为一条蛋白带,分子量为80 KDa,等电点（pI）为4.2,表明G-I已达至电泳纯,且为一种单链蛋白质,相对分子量为80 KDa。经胰蛋白酶水解、电喷雾四极杆飞行时间串联质谱（Q-TOF2）分析,获取了G-I中3个多肽链的氨基酸序列: 1. LVAHEENVR , 2.VGKDEGFAKAGGLSR ,3.LPLEAGESGTATFNVR。利用BLAST工具在NCBI非冗余蛋白数据库和欧洲生物信息学研究所（EBI）统一蛋白知识库中进行查询和比对,没有发现氨基酸完全相同的多肽段,表明此酶为一种新蛋白。将此肽段的氨基酸序列上传到统一蛋白知识数据库（UniProtKnowledgebase）,得到了其授予的序列接受号P85516。G-I的氨基酸序列与β-葡萄糖苷酶家族3的几种真菌β-葡萄糖苷酶有高度的同源性,可能属于此家族的成员之一。4、酶反应动力学实验证实,G-I具有较好的pH稳定性和热稳定性,在pH4.0～11.0范围内和40℃以下表现出良好的β-葡萄糖苷酶活性,最适反应pH值为pH6.0,最适反应温度为45℃。Cu²⁺,Zn²⁺在50mM时对酶活性有较强的抑制作用,相反,Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺和Mg²⁺对酶活性有轻微的刺激作用。0.25 M的SDS没有影响G-I的酶活性,0.25 mM的EDTA只是轻微抑制了G-I的活性。G-I的Km值为0.18 mM,最大反应初速度Vmax为5.52 mM/min。底物专一性分析发现,G-I能高特异性水解人工合成的底物pNPG,还能水解β-葡萄糖苷键连接的二糖如纤维二糖、龙胆二糖和槐二糖,再次表明此酶为一种β-葡萄糖苷酶。G-I对人参皂甙的底物专一性研究表明,此酶对人参皂甙Rb₁表现了很强的水解活性,可达到pNPG的22.1%,而不水解人参皂甙Rb₂、Rc和Rd,说明此酶对人参皂甙Rb₁中C-20位的β（1→6）糖苷键更具有特异性,不水解人参皂甙其它糖苷键,G-I对人参皂甙的这种高选择性水解为Rd的工业制备奠定了基础。