第一部分AF1Q蛋白通过分子伴侣介导的自噬途径降解的机制研究研究背景：白血病是最常见的血液系统恶性肿瘤,混合系白血病(MLL)基因重排是其常见的染色体异常。作为MLL的伙伴基因,AF1Q(即MLLT11)基因最初发现于两例伴有t(1；11)(q21；q23)的儿童急性粒单核细胞白血病患者中。在造血系统中,AF1Q表达于造血祖细胞和胸腺,但在外周血细胞和脾细胞中不表达。AF1Q通过与Notch信号通路合作参与前胸腺T细胞的生成并促进其向T细胞分化。前期研究表明,它与儿童急性髓系白血病(AML),成人正常核型AML和成人骨髓增生异常综合征的不良预后相关。目前AF1Q的生物学功能尚未完全阐明,但越来越多的研究表明AF1Q在多种实体瘤中发挥着原癌基因的作用。此外,AF1Q还可能参与肿瘤细胞凋亡的调控。研究报道,AF1Q的表达可直接受microRNA-29b的调控,且AF1Q蛋白可通过泛素介导的蛋白酶体途径在中心体区域进行降解。然而AF1Q的降解机制至今尚未被系统地阐明。泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统是哺乳动物细胞内蛋白降解最重要的两个系统。自噬是一种细胞利用溶酶体降解长寿命胞浆蛋白的方法。根据对底物降解机制的不同,自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)三类。与其它类型的自噬相比,CMA是一种选择性的降解胞浆蛋白的途径。通过CMA途径降解的胞浆蛋白含有一个KFERQ样基序,从而保证其可被HSPA8分子伴侣识别。与HSPA8形成复合体后,蛋白被交付给位于溶酶体膜的LAMP-2A,进一步输送至溶酶体腔进行降解。研究目的：研究自噬-溶酶体途径在AF1Q蛋白降解中的作用,阐明CMA降解AF1Q的分子机制,探讨CMA关键分子识别AF1Q的结构基础。研究方法：1.药物或饥饿处理细胞对AF1Q表达水平的影响：K562白血病细胞和HEK-293细胞分别用含有MG132、氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)或6-氨基烟酰胺(6-AN)的完全培养液培养。饥饿处理时,将培养液更换为Hanks平衡盐溶液(HBSS)进行细胞培养。各种处理后,提取蛋白和RNA行蛋白质印迹(Westernblot)和实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)。2.细胞转染：过表达或抑制细胞内某基因的表达时,使用lipofectamine2000瞬时转染细胞。3. Western blot实验：不同条件下处理的细胞使用Western及IP细胞裂解液裂解,用BCA试剂盒测蛋白浓度。全细胞裂解液使用SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,免疫印迹检测目的蛋白的表达水平。4. Real-time RT-PCR：不同条件下处理的细胞使用TRIzol法提取总RNA,行Real-time RT-PCR检测不同处理后AF1QmRNA表达水平的改变。5.免疫荧光显微技术：细胞转染AF1Q-GFP融合蛋白过表达质粒24小时后接种于含有细胞爬片的六孔板内培养24小时,固定、封闭后依次加入一抗和二抗孵育,激光共聚焦显微镜观察AF1Q与CMA关键分子在细胞内的共定位情况。6.免疫共沉淀(Co-IP)：全细胞裂解液去除非特异性结合后,依次加入AFlQ抗体和protein A+G agarose孵育,免疫沉淀产物使用SDS-PAGE进行凝胶电泳,免疫印迹检测目的蛋白与AFlQ蛋白是否存在生理学上的相互作用。7.统计学分析：统计方法使用Student’s t检验或单因素方差分析。P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果：1.溶酶体途径抑制剂或激活剂对AF1Q蛋白水平的影响：(1)溶酶体抑制剂CQ或蛋白酶体抑制剂MG132处理K562白血病细胞和HEK-293细胞24小时AF1Q蛋白水平明显增加。(2)巨自噬抑制剂3-MA处理K562细胞和HEK-293细胞24小时未见AF1Q蛋白水平增加。(3)CMA激活剂6-AN处理细胞24小时降低了K562细胞和HEK-293细胞AF1Q蛋白的水平。(4)饥饿处理12小时可见K562细胞AF1Q蛋白水平轻微降低,饥饿处理24小时显著降低了K562细胞和HEK-293细胞AF1Q蛋白的水平。(5) Real-time RT-PCR结果显示MG132、CQ、3-MA和6-AN处理24h后K562细胞和HEK-293细胞AF1Q mRNA水平均无明显改变。饥饿处理下K562细胞和HEK-293细胞AF1QmRNA水平在6h时均无明显变化,但在12h和24h时均可见明显增加。2.下调或过表达巨自噬相关分子对AF1Q蛋白水平的影响：(1)下调ATG5或ATG7表达可显著降低HEK-293细胞AF1Q蛋白表达水平。(2)过表达ATG5或ATG7可显著增加HEK-293细胞AF1Q蛋白表达水平。3.下调或过表达CMA关键分子对AF1Q蛋白水平的影响：(1)下调HSPA8或LAMP-2A表达可显著增加HEK-293细胞AF1Q蛋白表达水平。(2)过表达HSPA8或LAMP-2A可显著降低HEK-293细胞AF1Q蛋白表达水平。4.AF1Q蛋白与HSPA8和LAMP-2A蛋白的相互作用：(1)免疫荧光显示外源性AF1Q蛋白与内源性HSPA8和LAMP-2A蛋白均存在细胞内共定位现象。(2)Co-IP结果显示外源性AF1Q蛋白与外源性HSPA8和LAMP-2A蛋白均存在免疫共沉淀现象。5.鉴定AF1Q蛋白与CMA关键分子结合的靶向位点：(1)生物信息学比对发现AF1Q蛋白84-88aa存在可与CMA关键分子结合的KFERQ样基序。(2)删除AF1Q蛋白的CMA关键分子结合位点后CMA关键分子LAMP-2A对AF1Q蛋白表达水平的调控作用消失。结论：1.AF1Q在溶酶体中的降解是通过CMA而不是巨自噬途径来实现的。2.AF1Q蛋白与CMA关键分子HSPA8f3.LAMP-2A间存在生理学相互作用。3.AF1Q蛋白通过KFERQ样基序被CMA关键分子识别,从而通过CMA途径降解。第二部分氯化两面针碱抗急性髓系白血病的机制研究研究背景：急性髓系白血病(AML)是最常见的成人血液系统肿瘤,它以骨髓中髓系细胞及其前体细胞的增殖异常和分化阻滞为特征。尽管治疗方案在不断的改进,仍有许多AML患者预后不良。因此,仍需研究新的替代疗法,从而阻止疾病进展并提高患者生存率。天然药物疗法是一个很好的治疗包括AML在内的肿瘤的替代治疗方法,因为它们具有相对广泛的活性和相对低的毒性。氯化两面针碱(NC)是从花椒属植物两面针的根中提取的具有天然生物学活性的生物碱,已被证实对多种实体瘤细胞存在抗肿瘤效应。然而,NC对AML细胞的效应和机制尚未见报道。研究目的：研究NC对AML细胞生长、细胞周期和凋亡的影响及其具体机制,阐明NC对AML细胞信号通路的影响,探讨NC作为治疗AML的药物的可能性。研究方法：1.细胞存活实验：细胞处理后采用CCK8法检测细胞存活情况。2.流式细胞术检测细胞周期：NC处理细胞12h,采用碘化丙啶(PI)染色法检测其对细胞周期分布的影响。3.流式细胞术检测凋亡：NC处理细胞24h,应用Annexin V FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒检测其对细胞凋亡率的影响。4.蛋白质印迹(Western blot)实验：不同条件下处理的细胞使用Vestern及IP细胞裂解液裂解,用BCA试剂盒测蛋白浓度。全细胞裂解液使用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,免疫印迹检测目的蛋白表达水平。5.统计学分析：统计方法使用Student’s t检验或单因素方差分析。P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果：1.NC对AML细胞系的生长抑制效应：NC可抑制AML细胞HEL、NB4和THP-1的生长,且NC的生长抑制效应存在时间和剂量反应关系。2.NC对AML细胞细胞周期的影响：(1)NC处理后AML细胞G2/M期和S期比例增加,G1期比例下降。(2)NC处理后AML细胞Cyclin B1和CDK1蛋白表达水平明显降低,而p27蛋白表达水平明显增加。3.NC对AML细胞凋亡的影响：(1)NC处理24h明显增加了AML细胞的凋亡率。(2)NC处理后AML细胞Caspase-3激活、PARP失活。(3)NC处理后抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低,而促凋亡蛋白Bax表达水平明显增加。4.NC对AML细胞信号通路激活情况的影响：(1)NC可降低AML细胞AKT的磷酸化水平,抑制AKT信号通路的激活。(2)NC可降低AML细胞ERK的磷酸化水平,但是p-P38蛋白表达水平无明显改变。(3)NC可导致p-JAK2蛋白表达水平轻度降低,但未见其对p-STAT3蛋白表达水平产生影响。5.抑制AKT信号通路对NC作用下AML细胞生长抑制的影响AKT抑制剂LY294002可显著增强NC对AML细胞的生长抑制作用。6.抑制ERK信号通路对NC作用下AML细胞生长抑制的影响ERK抑制剂PD98059可显著增强NC对AML细胞的生长抑制作用。结论：1.NC通过细胞周期阻滞和诱导凋亡抑制AML细胞生长。2.NC对AML细胞的生长抑制作用部分是通过抑制AKT和ERK的磷酸化来实现的。3.NC可能成为一个新的抗白血病药物,进一步研究包括NC在内的中药单体的抗白血病效应可为AML的治疗提供新的方案。