立题意义及其依据： 中枢神经系统(CNS)内神经元的正常功能活动需要其周围微环境保持一定的稳定性，而保持这种稳定性的结构称为脑屏障。从解剖学角度来说，脑屏障分为三类：血脑屏障、血.脑脊液屏障、脑脊液—脑屏障。脑屏障(特别是血脑屏障，BBB)的存在有效地保护了脑组织，但同时也使98％对CNS很有效的药物，很难在脑内呈现出有效浓度与临床效果，达到对CNS的治疗作用。 目前，药物通过脑屏障主要途径有：①脑内直接注射或植入；②脑靶向鼻腔给药；③通过颈动脉输入高渗溶液，暂时性“开放”BBB；④酯化前体药物；⑤化学传递系统；⑥载体介导转运系统(营养转运载体)；⑦受体介导的胞吞转运；⑧基因导向酶前体药物疗法和抗体导向酶前体药物疗法；⑨修饰的药物载体系统(免疫脂质体和纳米粒子技术等)。 当前新型的药物传输系统(DrugDeliverySystem，DDS)，尤其是利用无毒的高分子材料为载体制备纳米制剂，作为透过BBB的手段近二十年来已引起人们的极大关注。本研究采用的载体材料为聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)，是已沿用近50年的经典生物可降解材料，近年来广泛用作纳米载体材料。但是普通的载药纳米粒在血液循环中易被富含巨噬细胞的脏器(如肝、脾)摄取，从而阻止了它向非巨噬系统(如脑)的聚集。因此，对它们表面进行化学修饰，以提高透过BBB的脑靶向性，为临床脑肿瘤治疗提供新的方案，临床意义重大。 目前最有希望的方法是用亲水性表面活性剂对纳米粒进行包衣或将其与聚氧乙烯共价交联，形成空间位阻效应，减少其在巨噬细胞表面的粘附，从而提高它在非吞噬系统器官的聚集，达到透过BBB的效果。表面活性剂tween—80已被证实能促进PBCA—NP的趋脑性及BBB透过性。虽然对用tween—80包衣纳米粒能透血脑屏障的研究报道很多，但是其透过血脑屏障的机制还不甚清楚，目前认可的机制有：①脑毛细血管内皮细胞的胞饮作用；②抑制P—糖蛋白；③聚合物降解破坏BBB等。 GulyaevAE等证明：用tween—80对doxorubicin—PBCA—NP进行包衣后，静脉注射小鼠，在小鼠脑内测得doxorubicin含量是静脉注射doxorubicin溶液的60倍。SchroedcrU等制备dalargin—PBCA—NP用吐温—80包衣后，进入脑内的dalargin量是未包衣的纳米粒的3倍，而且进入肝脏的量减少。AlyautdinRN等同样证实了用包衣后loperamide—PBCA—NP静脉注射小鼠后使小鼠产生持续的镇痛作用。 国内在制备PBCA—NP方面有学者进行过研究，如华西医科大学用米托蒽醌(mitoxanttone)为模药，制备了PBCA肝靶向纳米粒，在动物体内显示良好的抗癌性和肝靶向性。此外，还有庆大霉素，阿霉素等肝靶向纳米粒制剂的研究。但是，用表面活性剂tween—80对GCTB—PBCA—NP进行包衣制备主动脑靶向性制剂，治疗恶性肿瘤国内外未见报道。因此，本课题具有一定的创新性。 吉西他滨(gemcitabine，GCTB)是一个新型的脱氧胞苷拟似物和核苷还原酶抑制剂，属嘧啶类抗代谢肿瘤药物。该药在20世纪80年代末及90年代初进入体外和动物体内抗癌活性研究。1992年开始进入Ⅰ、Ⅱ、III期临床研究。美国FDA于1996年5月率先批准该药进入临床使用，我国于1999年引进。与阿糖胞苷等已在临床应用的嘧啶类抗代谢肿瘤药物相比，吉西他滨抗肿瘤活性强，抗瘤谱广。现已证实该药对多种实体瘤治疗效果显著。 方法与结果： 采用乳化聚合法制备GCTB—PBCA—NP，并以GCTB—PBCA—NP的粒径、包封率和载药量为指标，通过对搅拌速率、乳化聚合时间、乳化溶液pH值、有机溶剂的选择、BCA单体滴加速度、BCA单体浓度、GCTB质量和稳定剂Dextran—70的量等进行单因素考察，其中BCA单体浓度、GCTB质量和稳定剂Dextran—70的量等因素影响较大，通过正交设计优化处方和制备工艺。制备的GCTB—PBCA—NP平均粒径为(112±9)nm，包封率为(54.12±2.43)％，载药量为(11.08±0.89)％。 发现制备的GCTB—PBCA—NP胶体溶液在室温和4℃条件下，有模型药物的析出，而且纳米粒絮凝在一起。说明液体剂型不适于本制剂的保存与使用，满足不了临床应用要求，故制备其冻干制剂。本实验选用了四种不同冻干保护剂：海藻糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇，以冻干制剂的外观和色泽、再分散性、粒径和包封率为依据，对不同种类和浓度的冻干保护剂进行了筛选，综合各指标评估，最终选定甘露醇为冻干保护剂，且浓度为2.5％(m/v)。 为了尽可能模拟体内释药环境，而进行了GCTB—PBCA—NP冻干粉体外释药试验研究，选用pH值为7.4的PBS磷酸盐缓冲液滴加1％的tween—80作为体外释放介质。用动态透析系统研究其体外释药行为特点，运用不同的数学模型：Higuchi、Nicbergull、Monoexponential、Weibull及Hixcon—Crowell模型对纳米粒的累积释放度数据进行拟合。而且在本实验中，Weibull模型的拟合度R2为最高(R2=0.993)，拟合最好，所以Weibull模型方程可以最好地拟合本实验的体外释放曲线。并计算得到GCTB—PBCA—NP的体外释药半衰期为8.25h。 为了考察tween—80包衣吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(GCTB—PBCA—NP)脑内靶向分布。建立了生物样品中GCTB的反相高效液相色谱(RP—HPLC)测定法，并测定了小鼠给药后的血浆及脑组织中GCTB浓度(小鼠给药剂量为132mg·kg—1，尾静脉注射)。结果发现：与GCTB溶液组、GCTB—PBCA—NP胶体溶液组以及1％tween—80+空白PBCA—NP+GCTB混合液组相比，1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP能大大地增加脑组织内浓度，有显著性差异(P<0.05)。 研究了1％Tween—80包衣吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(GCTB—PBCA—NP)对C6脑胶质瘤细胞生长抑制作用，并考察其对细胞增殖和凋亡的影响。实验分成1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组、GCTB+空白PBCA—NP+1％tween—80组、PBCA—NP+1％tween—80组、模型药物GCTB组和仅加入培养液的空白对照组，倒置显微镜下观察各组转染胶质瘤细胞后的生长状态；流式细胞仪(FCM)检测各组转染细胞后细胞周期变化；采用CCK—8法测定各组对细胞的毒性和细胞增殖的影响。与空白对照组相比，其他各组转染后的C6细胞形态均发生改变，细胞失去原有的贴壁特性，生长密度降低，生长状态变差，其中以1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组最为明显，呈时间依赖性；各组细胞周期发生变化，表现G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例减少，其中1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组差异非常显著(P<0.01)；除空白纳米组外，各纳米粒组对细胞增殖的抑制效应随GCTB相对终浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性特征，其中1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组抑制效应明显优于其他各组。1％Tween—80包衣GCTB—PBCA—NP转染C6细胞后，能有效抑制细胞增殖及改变细胞周期，对胶质瘤细胞生长有明显抑制作用。 本课题也对主动脑靶向制剂tween—80包衣吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的药效学进行了考察。方法是用C6脑胶质瘤细胞制作了SD大鼠恶性肿瘤脑胶质的动物实验模型，14天后，随机分成3组，各组分别给予1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP、模型药物GCTB和对照组(生理盐水)进行治疗，大鼠给药剂量按GCTB90mg·kg—1，静脉注射。最后进行各组动物模型的生存曲线分析，病理组织形态学考察。结果是1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组、模型药物GCTB组和对照组(生理盐水)的肿瘤模型动物平均生存时间分别为(25.50±2.18)天、(23.70±2.28)天和(21.50±2.00)天。与对照组相比，1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组有显著性差异(P<0.05)；与模型药物GCTB组相比，1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP组没有显著性差异，但平均生存时间延长。 结论与讨论： 本研究所制备的GCTB—PBCA—NP粒径大小、分布合适，电镜下观察GCTB—PBCA—NP为圆形，均一性好。由于药物GCTB水溶性强，包封率和载药量不是很高。体外释药研究证实制备的GCTB—PBCA—NP均具有一定的缓释特性并符合Weibull模型，其释药机制可能是被动扩散和溶蚀共同作用。动物体内组织分布实验表明1％tween—80包衣的GCTB—PBCA—NP有一定的脑靶向作用。1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP对C6脑胶质瘤细胞有生长抑制作用，同时1％tween—80包衣GCTB—PBCA—NP能使接种C6脑胶质瘤细胞的SD大鼠模型的平均生存时间延长。