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非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是危害人类生命最常见的恶性肿瘤之一,约有2/3左右的非小细胞肺癌患者就诊时都已不能手术治疗,单纯的放疗或化疗的效果都不理想。以分子标志物为靶点的靶向治疗具有更强的针对性,疗效更明显,成为了NSCLC治疗的研究热点。不幸的是分子靶向药物治疗一段时间后会产生耐药,给临床造成了极大的困扰,所以研究肺癌靶向药物的耐药机制尤为重要。棘皮动物微管蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因是一个新的治疗靶点,在肺癌中的研究相对较少,有关耐药机制的研究更少。鉴于以上问题,本课题旨在建立EML4-ALK靶向药物克唑替尼的耐药细胞模型,鉴定其耐药性,并初步探讨其耐药机制。本实验采用克唑替尼浓度递增的方法诱导非小细胞肺癌H3122细胞构建非小细胞肺癌克唑替尼耐药细胞H3122CR。倒置显微镜观察亲本细胞和耐药细胞的形态学差异。采用CCK8法绘制细胞生长曲线并测定亲本细胞和耐药细胞对克唑替尼的敏感度,计算耐药指数。流式细胞术检测肺癌H3122和H3122CR细胞的凋亡率以及周期分布的差异。实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肺癌细胞H3122和H3122CR中耐药相关基因EML4-ALK和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)的mRNA表达水平。基因测序技术测定肺癌H3122和H3122CR细胞中miRNA的表达变化,并进一步筛选差异表达的miRNA。用荧光定量RT-PCR验证差异表达的mi RNA。采用脂质体2000将miR-10a-5p mimics转人H3122CR细胞,检测转染后细胞对克唑替尼敏感度的变化以及细胞周期的变化。历时6个月成功建立了克唑替尼耐药细胞H3122CR,耐药后细胞体积增大,长伪足,触角伸长,耐药指数为9.86。与H3122相比,H3122CR细胞凋亡率明显降低(P<0.001);细胞胞周期分布产生了显著的变化,S期比例减少(P<0.01),G1期和G2期比例增加(P<0.05);耐药相关基因EML4-ALK和BCRP的mRNA表达水平明显上调。第二代测序和RT-PCR结果显示,耐药细胞H3122CR中hsa-mi R-30a-5p,hsa-miR-374c,hsa-miR-143-3p,has-miR-148a-5p,hsa-mi R-125b-5p表达上调,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-3182,hsa-mi R-148a-3p,hsa-miR-200c-3p,hsa-miR-7-5p和hsa-mi R-10a-5p表达下调。将miR-10a-5p mimics转染H3122CR细胞结果发现,高表达的mi R-10a-5p能一定程度改善耐药细胞对克唑替尼的敏感度,同时使细胞在G1期比例下调。综上所述,建立的H3122CR耐药细胞对克唑替尼具有一定的耐药性,为进一步研究耐药机制以及逆转耐药提供基础。高表达的EML4-ALK和BCRP很可能参与了克唑替尼的耐药,并且部分miRNAs可能也参与了克唑替尼的耐药。