论文部分内容阅读
莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体感染引起的一种人畜共患自然疫源性蜱媒传染病。该病的主要传播媒介为蜱虫,蜱虫主要生长在距地面20-30cm的草木顶端,人们经过生长有蜱的草丛中而无防护措施可能会导致蜱虫叮咬引发莱姆病。该病主要在中国的东北、西北和南方的林区以及草原地带较常见[1-4],人体感染莱姆病症状主要分为早期,中期,晚期,早期主要表现为典型的慢性游走性红斑(EM),其他早期症状可能包括发烧、头痛和疲劳。如果得不到及时治疗,可能会导致中期或晚期症状:主要包括神经性损伤,关节痛,伴有颈部僵硬的严重头痛,心肌炎等[5],病情迁延不愈可能会出现莱姆病后综合征(PLDS)[6],具体表现为轻微到严重的肌肉骨骼疼痛、疲劳或注意力和记忆困难等。研制有效的疫苗是控制莱姆病的有效措施,但目前尚无针对莱姆病的疫苗研制成功。莱姆病疫苗的研究主要包括亚单位疫苗,DNA疫苗等。考虑到莱姆病螺旋体基因结构和抗原性方面的多态性和异质性,即不同基因型间菌株难以获得良好的交叉免疫保护,解决此问题的方法是研制针对不同地区主要致病基因型或亚型的多价亚单位疫苗。本研究旨在克隆表达中国莱姆病螺旋体主要致病基因型B.garinii基因型代表菌株PD91外膜蛋白A(OspA)的126-274aa肽段(缩写:PD91-rOspA-pep),并且探究其与中国莱姆病螺旋体B.garinii和B.afzelii基因型的OspC蛋白组合的重组多价亚单位疫苗的免疫保护性,从而为中国莱姆病亚单位疫苗的研制提供基础。第一部分采用聚合酶链反应(PCR)扩增莱姆病螺旋体PD91的126-274aa OspA肽段基因,克隆至原核表达载体pET-30a上,构建pET-30a-OspA-pep重组质粒,转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达,表达产物用Ni-IDA树脂层析纯化,SDS-PAGE电泳检测、并通过Western blot分析其免疫原性;将不同剂量的rOspA-pep蛋白(20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、80μg、100μg)免疫新西兰家兔,采用间接免疫荧光方法(IFA)检测免疫前后的抗体滴度,选取产生抗体滴度最高的剂量组为最佳剂量组,并用最佳剂量组的免疫兔血清进行体外中和试验以检测rOspA-pep蛋白的体外杀菌能力;用最佳剂量的rOspA-pep蛋白免疫新西兰家兔,观察其抗体滴度变化。第二部分采用PD91和FP1的rOspC组合蛋白,免疫新西兰家兔,每组包含20、30、40、50、60、80和100 μg 7个剂量组和1个空白对照组(0 μg),共8个剂量组,对照组注射PBS溶液;IFA方法检测免疫前及免疫后兔血清第15、30、45、60天抗体(IgG)滴度,确定rOspC蛋白最佳免疫剂量;并用最佳剂量组的免疫兔血清进行体外中和试验以检测rOspC组合蛋白的体外杀菌能力。选取10只新西兰家兔,按最佳剂量免疫rOspA-pep+rOspC蛋白。第1天对其进行首次免疫,第30天进行加强免疫。取首次免疫后第15、30、60、90、120、150和180天血清检测IgG抗体(IFA法),绘制抗体滴度变化曲线,观察抗体持续时间,并确定最佳攻菌时间。另取16只新西兰家兔,设两个攻菌剂量组。每组随机选取5只设为攻菌组,按最佳剂量免疫rOspA-pep+rOspC蛋白;另3只作为空白对照组,皮下注射与攻菌组相同蛋白体积的PBS溶液。第1天对其进行首次免疫,第30天进行加强免疫,首次免疫60天后进行体内攻菌实验。两组家兔体内分别皮下注射2×10s、2×106/ml PD91活菌;第5周解剖取肾脏和膀胱进行分离培养和核酸检测。提取组织中DNA,巢式PCR方法扩增伯氏疏螺旋体5S-23SrRNA间隔区250bp目的片段,整理阳性标本数据并对其进行分析。第一部分结果:重组质粒pET-30a-OspA-pep构建成功并在宿主菌体内高效表达;Western blot结果表明rOspA-pep与莱姆病螺旋体PD91的多抗存在较好的抗原抗体反应;间接免疫荧光方法(IFA)检测结果表明rOspA-pep蛋白免疫兔血清IgG抗体滴度明显升高(最高可达1:2480),40μg为rOspA-pep的最佳免疫剂量;体外中和试验表明:40μg rOspA-pep蛋白免疫后产生的抗体对106/ml的B.garinii和B.afzelii型代表菌株PD91和FP1的中和率达100%,对107/ml的FP1的中和率为100%,对107/ml的PD91的中和率为60%。用40μg rOspA-pep在第1天和第30天免疫新西兰家兔2次后,45-60天其抗体达到高峰,持续时间约为3-4个月,之后抗体滴度逐渐下降。第二部分结果:PD91和FP1的rOspC组合蛋白免疫新西兰家兔后,IFA检测结果表明rOspC蛋白免疫的兔血清IgG抗体滴度明显升高(最高可达1:1024),30μg为rOspC蛋白的最佳免疫剂量;30μg rOspC蛋白免疫后产生的抗体对106/ml的B.garinii和B.afzelii型代表菌株PD91和FP1的中和率达100%。10只家兔在免疫2次40 μg rOspA-pep+30μg rOspC蛋白之后,抗体在45-60天可达到高峰,维持60-90天左右开始呈下降趋势;体内攻菌实验结果表明:在攻菌剂量为2×105cfu组中,免疫组和对照组家兔的组织核酸检测均为阴性,免疫组和对照组结果无差异。提示在受到低剂量莱姆病螺旋体攻击时,家兔自身产生的抗体即可中和病原,起到保护作用;在攻菌剂量为2×106cfu组中,免疫组5只家兔组织中核酸检测均为阴性,而对照组3只家兔中有1只家兔的组织中核酸检测阳性,并经测序确定为B.g型。提示攻菌剂量为2×106cfu时,40 μg rOspA-pep+30μg rOspC的蛋白组合成分对家兔具有一定的免疫保护性。综上所述,中国莱姆病螺旋体B.garinii基因型代表菌株PD91的126-274aa OspA肽段具有较好的免疫原性和体外中和菌的能力,可作为中国二代亚单位疫苗的候选成分;并且本研究在中国首次证实rOspA-pep和rOspC组合的多价亚单位疫苗成分在新西兰家兔受到高剂量(2×106cfu)莱姆病螺旋体攻击时可保护其免受感染。此研究为设计基于OspA肽段和OspC的中国莱姆病多价亚单位疫苗提供基础数据。