厌氧氨氧化细菌内纳米舱的结构与功能研究

来源 :中国科学院大学(中国科学院重庆绿色智能技术研究院) | 被引量 : 0次 | 上传用户:uuu_uuu
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厌氧氨氧化是地球氮循环的重要组成部分,也是污水生物脱氮和环境修复的重要基础,释放到大气中大约50%的氮可以归因于厌氧氨氧化活动。作为厌氧氨氧化的执行者,厌氧氨氧化细菌近年来已成为微生物、环境、地质等领域的研究热点,但对厌氧氨氧化细菌内部结构的研究仍处于起步阶段。特别是厌氧氨氧化细菌基因组中含有纳米舱基因位点,然而对于厌氧氨氧化细菌的纳米舱的功能和结构了解甚少。通过透射电镜观察厌氧氨氧化细菌的精细结构,发现在其外部存在一些类似于蛋白笼结构的同心圆环结构,其直径在50-60nm。然后设计一种新的方法(溶菌酶+磷脂酶)对厌氧氨氧化细菌内部物质进行分离,利用透射电镜发现在其内部也存在类似蛋白笼的结构,其直径在55-150nm之间。蛋白质谱检测数据也说明厌氧氨氧化细菌内存在纳米舱壳蛋白(cEnc)和载体蛋白(HAO)。综上推测在厌氧氨氧化细菌内部应该存在纳米舱。利用分子生物学的方法将纳米舱壳蛋白在大肠杆菌中进行表达,纯化,并基于透射电镜和原子力扫描电镜发现壳蛋白能够在体外自组装形成稳定的直径在34nm左右的球状颗粒。然后利用200KeV冷冻电镜解析球状颗粒的精细结构,发现在其内部还形成一个23nm左右的球形结构。通过蛋白序列分析,发现厌氧氨氧化细菌的纳米舱壳蛋白N端有一段独有的氨基酸序列,经过建模预测推测其为细胞色素c。然后利用基因工程的方法将壳蛋白N端独有的65个氨基酸序列去掉,形成壳蛋白突变体,并进行异源表达,发现突变体蛋白也可以在体外形成28nm左右的球状颗粒。基于透射电镜和能谱(TEM+EDX)分析,发现厌氧氨氧化细菌的自组装形成的空载纳米舱可以在体外吸附银离子。通过测定细菌存活率,发现当暴露于30μM硝酸银环境下,工程菌(含有纳米舱)的存活率是86%,而野生型细菌(不含纳米舱)只有59%,说明纳米舱也可以转入到大肠杆菌中,辅助细菌抵抗银离子胁迫。通过蛋白质组学分析了纳米舱辅助细菌抵抗银离子毒性的潜在机制,银离子(Ag+)进入细胞,然后产生活性氧(ROS),分解细胞膜和DNA,导致细胞裂解。纳米舱可以隔离银离子,诱导蛋白质加工和次生代谢产物的相关蛋白上调,从而保护细胞免受银离子的胁迫。利用分子生物学的方法将厌氧氨氧化细菌的cEnc和HAO基因进行拷贝,转入到大肠杆菌中进行表达,在透射电镜下发现cEnc和HAO蛋白可以形成128nm左右的同心环状结构。通过测定细菌的生长曲线,发现在50 mg L-1(以N计)羟胺条件下,工程菌(含有封装HAO酶的纳米舱)的生长速率远高于野生菌,工程菌可以转化90%的羟胺,而野生菌仅为46%,说明纳米舱可以辅助细菌抵抗羟胺压力。通过蛋白质组学分析,发现羟胺会破坏野生菌核糖体参与的蛋白翻译过程,从而导致野生型细菌无法进行繁殖生长。但对于工程菌,可以通过封装HAO酶的纳米舱对羟胺进行分解,从而降低羟胺的浓度。工程菌也可能通过上调参与应激反应与刺激反应的相关蛋白,从而降低细胞内羟胺的毒性。此外,通过逆转录酶定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的方法,发现相对于3.12g L-1的厌氧氨氧化细菌颗粒,其对羟胺的承受压力介于60-70 mg L-1之间。在羟胺浓度为50mg L-1时,cEnc和HAO的mRNA表达量会随着羟胺的加入不断升高,而后出现降低,由此推测封装HAO的纳米舱也可能参与厌氧氨氧化细菌羟胺代谢,并辅助厌氧氨氧化细菌抵抗羟胺压力。利用分子生物学的方法将亚硝酸还原酶(NIR)和复合蛋白(cEnc-NIR)在大肠杆菌成功地进行了异源表达,基于透射电镜观察到纳米舱可以封装NIR酶,并形成200nm的同心圆环结构。同时批次实验观察到亚硝酸盐会对厌氧氨氧化细菌活性产生影响,并基于RT-qPCR技术发现封装NIR的纳米舱的相关基因表达量会随着亚硝酸盐的加入出现先增高后减少的趋势,推测封装NIR酶的纳米舱参与厌氧氨氧化细菌亚硝酸盐相关代谢。根据本文的研究结果,推测这种纳米舱的主要功能是辅助厌氧氨氧化细菌抵抗羟胺的胁迫,并参与厌氧氨氧化细菌亚硝酸盐代谢循环。同时厌氧氨氧化细菌纳米舱对毒性银离子有较高的吸收性能,未来可以用于开发功能解毒材料。综上所述,纳米舱可能为厌氧氨氧化细菌抵抗环境中潜在的抑制物提供一种新的策略。
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