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目的:糖尿病神经源性膀胱(Diabetic Neurogenic Bladder,DNB)是糖尿病患者常见的泌尿系统并发症。DNB的发病及进展具有时间依赖性,是在糖尿病病程的进展中逐渐累积加重的过程。现阶段尚无针对DNB的理想治疗手段,临床上只能通过对症处理缓解症状,并不能有效阻断DNB的进展及恢复已受损的膀胱功能。DNB的发病机制尚未完全清楚,国外文献报道:糖尿病大鼠模型L6-S1处脊髓背根及靶器官膀胱中神经生长因子(Neuron Growth Factor,NGF)的减少与DNB的发生发展密切相关。进一步实验证实通过补充外源性NGF可有效改善DNB症状并减缓疾病进展,提示补充NGF可能是治疗DNB的可行方案。因此,找到补充外源性NGF的合适方法及途径是研究的重点方向。人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUCMSCs)不仅具备多向分化的潜力同时又是良好的基因载体细胞。鉴于此,本课题在构建含人NGF的重组慢病毒载体并转染至hUCMSCs,并使hUCMSCs持续稳定表达NGF的基础上,将处理后的hUCMSCs移植到支配膀胱的L6-S1处脊髓背根,使外源性NGF和人脐带MSCs分别发挥基因治疗和细胞治疗作用,从而为DNB的治疗提供新思路。本论文研究主要有细胞实验及动物实验组成。在细胞实验部分,主要涉及脐带干细胞的提取、鉴定以及神经生长因子NGF的转染,为进一步的动物实验打下基础。在动物实验部分,本课题参照相关文献,选用SD雌鼠并利用链脲佐菌素(Streptozocin STZ)腹腔注射完成糖尿病模型的建立,并在建模成功3天后通过鞘内注射的方式向L6-S1脊髓背根处移植不同组hUCMSCs旨对疾病的进展进行早期干预。8周后通过尿动力观察各组大鼠排尿情况,并利用免疫组化、WB、免疫荧光的实验手段检测移植部位相关指标变化以及移植干细胞的存活分化情况,初步探究转染NGF基因的hUCMSCs改善DNB的作用机制。方法:1.hUCMSCs的分离与鉴定:从健康新生儿脐带中提取原代hUCMSCs;利用流式细胞仪对原代hUCMSCs细胞表面标记物进行鉴定;通过成骨成脂诱导分化实验,检测成骨成脂分化效果;验证hUCMSCs的多向分化能力;2.过表达NGF的慢病毒转染:筛选最佳MOI后使用慢病毒转染hUCMSCs;荧光显微镜拍照,估算转染效率;3.动物模型制备:通过一次性腹腔注射65mg/kg STZ制备SD大鼠糖尿病模型;观察记录大鼠空腹尾静脉血糖变化;4.转染NGF的hUCMSCs移植治疗及机制探究:分别通过鞘内注射转染NGF的hUCMSCs、hUCMSCs、慢病毒NGF-lentivirus以及PBS至大鼠L6-S1脊髓背根处;8周后检测其尿动力学参数改变情况,切片观察其膀胱组织改变;免疫组化Western Blot检测各组移植部位NGF、BDNF、NT-3等神经营养因子水平变化;免疫荧光共定位检测移植后NGF-MSCs的定位及分化情况。结果:1.原代hUCMSCs细胞形态呈长梭、漩涡状生长,hUCMSCs表达间充质表面抗原CD29、CD44,CD90,CD105,基本不表达白细胞标志抗原CD31、CD45,造血前细胞表面抗原CD34和HLA-DR。HLA-DR不表达证明hUCMSCs免疫原性低。分别诱导分化hUCMSCs具有成骨和成脂分化潜能,证实hUCMSCs具有多向分化能力;2.构建过表达NGF的慢病毒载体并成功转染至hUCMSCs,并能够稳定持续表达NGF;3.腹腔注射STZ 72小时后大鼠空腹尾静脉血糖升高均≥16.7mol/L,逐渐出现多饮、多食、多尿等典型糖尿病症状,体重明显减轻。8周后尿流动力学检测示最大膀胱容量增大,排尿点压力增加,残余尿增多,膀胱顺应性增高,逼尿肌收缩力弱;膀胱HE染色示膀胱逼尿肌纤维排列紊乱;4.通过鞘内注射移植后,在NGF-hUCMSCs与hUCMSCs组中大鼠DNB的尿流动力学参数较NGF-lentivirus组及PBS对照组有改善(P<0.05),而NGF-hUCMSCs组要优于hUCMSCs组(P<0.05)。HE染色示膀胱组织学示同样结果。注射部位L6-S1免疫组化染色、Western Blot示移植NGF-hUCMSCs及hUCMSCs后,其NGF、BDNF、NT-3阳性表达增加,而NGF表达水平在NGF-hUCMSCs组增高尤为显著(P<0.01)。免疫荧光共定位提示移植后干细胞能够表达神经元特异性抗体Neu N及星型胶质细胞特异性抗原GFAP。结论:1.证实提取的新生儿hUCMSCs具有较高的增殖能力及多向分化能力,体外培养多代的hUCMSCs仍然具备干细胞的基本生物学特性且免疫原性低;2.成功构建携带过表达NGF的慢病毒载体;3.成功构建DNB大鼠模型;4.鞘内注射NGF-hUCMSCs、hUCMSCs能够缓解的进展、提高神经营养因子表达;5.移植后hUCMSCs能够分化为神经元及星型神经胶质细胞。本试验结果证明hUCMSCs移植不仅是一种潜在的细胞治疗手段,也是一种良好的基因治疗载体细胞,我们发现在疾病早期单纯的移植hUCMSCs后,能够一定程度上减缓疾病的进展,提示干细胞hUCMSCs移植具备潜在的治疗效果。而通过在早期移植转染NGF的hUCMSCs,不仅能够使hUCMSCs发挥细胞治疗作用,又能根据疾病特点针对性补充外源性NGF,充分发挥hUCMSCs的治疗潜力,达到细胞治疗及基因治疗的双重效果。