Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)是一种慢性器官特异性自身免疫疾病,通常认为T1D是由于胰岛β细胞被自身反应性T细胞破坏而致病,因此导致自身胰岛素分泌绝对缺乏,属于胰岛素依赖性糖尿病。其首选治疗方案为模拟胰岛素分泌治疗,但仍有血糖控制不良、急慢性并发症发病率高等问题。为了更加稳定地控制血糖、减少治疗的副作用,有必要研发新的、更安全有效的治疗策略,靶向免疫系统和β细胞内源性途径的多种药物联合治疗策略将可能是未来治疗T1D的发展方向。越来越多的证据表明,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)与多种自身免疫性疾病密切相关。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是具有多种功能的细胞器,负责蛋白折叠、钙的储存以及促凋亡和抗凋亡通路的信号传导,对于建立细胞稳态有着不可或缺的作用。慢性炎症和异常环境因素会造成ER稳态失衡发生ERS。当ER中错误折叠蛋白过度累积时,细胞通过激活非折叠蛋白反应(UPR)的三条典型信号通路进行应答,这三条信号通路与内质网膜上的3种跨膜蛋白有关,即:阻抗性激酶lα(inositol re-quiring protein l-alpha,IRE1),双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶(PRK-like ER associated kinase,PERK)和活化的转录因子6(activating transcriptionfactor6,ATF6)。正常生理状态下,这些跨膜蛋白与内质网分子伴侣(Bip或GRP78)稳定结合,发生ERS时,BiP表达上调,激活UPR中上游调控组件IRE1α,ATF6和PERK,分别从转录、翻译层面减慢蛋白质合成速率,共同作用减少内质网错误折叠蛋白负荷。然而在病理条件下,UPR的慢性激活可导致细胞功能障碍和细胞死亡。同时,硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)作为一种硫氧还蛋白(TRX)结合蛋白,会使ERS情况恶化,参与内质网破坏性应激过程的起始、未折叠蛋白反应、炎症和细胞死亡等。近年来研究显示:ERS作为T1D早期重要的病理特征,参与T1D的启动和发展。胰岛β细胞作为专职分泌细胞,具有非常发达并受到精细调控的ER。遗传因素和包括病毒感染、化学物质暴露、活性氧增加、血糖异常、胰腺炎症等环境因素均参与诱导胰岛β细胞发生持续病理性ERS,促进β细胞功能受损及死亡。胰岛β细胞ERS相关基因位点差异与T1D易感性密切相关。在非肥胖型糖尿病(Nonobese diabetic,NOD)小鼠模型和T1D易感人群中,β细胞ER关键基因突变及功能缺失加速T1D发生及加重病情。在NOD小鼠模型、病毒感染诱导的T1D大鼠模型以及临床T1D病人的研究中,均发现β细胞ERS标志分子表达的显著增加出现在T1D发生之前。另外,最新研究显示病理性ERS可通过诱导胰岛β细胞内异常的蛋白质翻译后修饰,产生“Neo-antigenic peptides”,进而活化潜在的自身反应性T细胞,以启动或加剧T1D进展。有文献报道在糖尿病前期使用ERS化学缓解剂牛磺熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)可显著降低T1D小鼠模型的糖尿病发生率;以ABL-IRE1α信号为靶点,可以削弱胰岛β细胞ERS逆转自身免疫性糖尿病。因此ER可能成为治疗T1D的新关键靶标。甘露糖天然存在于许多植物中,特别是蔓越莓。在生理条件下,机体内甘露糖的血液浓度低于葡萄糖的五十分之一,主要参与某些蛋白质的糖基化。临床上甘露糖可用于治疗先天性Ib型糖基化紊乱及细菌性尿路感染。有研究显示:甘露糖能抑制伤口愈合时的炎症反应,可直接清除体内过剩自由基和脂质过氧化物,有效防止或减轻氧自由基导致的组织氧化损伤。最近研究发现甘露糖可以促进具有免疫抑制功能的调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的分化可改善自身免疫性及过敏性炎症。口服甘露糖还可改变肠道微生物,改善宿主代谢预防高脂饮食诱导的肥胖;还能通过抑制IL-6分泌增强牙周韧带干细胞的免疫调节作用。另外有研究发现,甘露糖能通过干扰葡萄糖代谢抑制肿瘤生长,并且联合化疗可以促进肿瘤细胞凋亡。这些研究使甘露糖的功能及作用备受瞩目。鉴于胰岛β细胞受到遗传及环境因素的影响而发生持续性病理性ERS,是T1D重要的致病因素,而甘露糖具有抗氧化、抗炎等广泛的生物学活性,本研究拟探讨甘露糖能否改善胰岛β细胞病理性ERS,从而保护胰岛β细胞功能并促进其存活,进而改善胰岛炎症,为甘露糖将来应用于临床防治T1D提供理论基础及实验数据。具体而言我们做了以下工作。在第一部分的研究中,分离各时间点的正常饮水(对照)组或饮甘露糖溶液(实验)组NOD小鼠胰腺组织,进行H&E染色,做胰岛病理评分。结果显示:与对照组相比,实验组NOD小鼠胰腺组织在处理1、2、3、7周时,均显示出明显减少的胰岛淋巴细胞浸润以及明显减轻的胰岛炎症。为检测口服甘露糖对NOD小鼠外周淋巴细胞的影响,分离各组NOD小鼠的脾脏及肠系膜淋巴细胞,利用流式细胞技术检测淋巴细胞表面抗原CD3、CD4、CD8、CD25,胞内细胞因子IFN-γ分泌及转录因子Foxp3表达。结果显示:与对照组相比,实验组NOD小鼠外周CD3~+CD4~+T细胞频率在1、2、7周均持续显著下调,CD8~+T细胞频率在喂养1周时出现一过性上调,喂养7周时下调显著,但CD4~+T细胞和CD8~+T细胞分泌促炎因子的能力均无明显差异。而在给予甘露糖1-3周时,NOD小鼠外周Treg细胞均无明显变化,但在连续饮甘露糖溶液7周后出现明显上调。鉴于ERS是T1D早期重要的病理特征,且参与T1D启动和发展。第二部为观察饮甘露糖溶液是否可以调节NOD小鼠胰腺组织的ERS水平,我们检测了饮甘露糖溶液不同时间点NOD小鼠腺胰组织ERS标志物的变化。实时荧光定量PCR结果显示:BIP、CHOP mRNA水平在持续饮用甘露糖溶液组1、2、3、7周时均呈现降低趋势,表明胰腺组织ERS标志物转录水平均在甘露糖处理后被抑制。Western Bloting结果表明:与对照组相比,连续饮用甘露糖溶液2、3、7周时,NOD小鼠胰腺组织病理性ERS标志物TXNIP均明显降低,减慢T1D启动及发展;Eif2α磷酸化蛋白水平在给予甘露糖2-3周时出现一定程度的适应性上调,减少蛋白质合成,减轻ER中未折叠蛋白质的负荷;Ire1在2周蛋白磷酸化表达量降低,有利于减少β细胞早期ERS反应性凋亡,保护β细胞存活,以维持胰岛细胞功能稳态。但随着疾病进程,甘露糖则能抑制持续性ERS,防止其向病理性ERS过度。第三部分我们进一步在体外培养体系观察甘露糖处理是否可以抑制ERS诱导剂诱导的胰岛β细胞系NIT-1过度ERS及死亡,并促进其存活。结果表明单独给予NIT-1细胞衣霉素(Tunicamycin,TM)处理后,BIP、ATF4、CHOP mRNA表达水平急剧上调,Eif2α、Ire1及其磷酸化蛋白含量均显著上调;但同时给予甘露糖处理后,这些ERS标志物在mRNA水平及磷酸化蛋白的上调水平均被明显抑制,且其抑制效果可以与ERS经典抑制剂TUDCA媲美。利用CCK-8法检测单独给予ERS诱导剂胡萝卜毒素(Thapsigargin,TG)/TM处理,或同时给予不同浓度甘露糖处理后的NIT-1细胞活性;并用台盼蓝法鉴定细胞生死状态。结果表明给予甘露糖可以明显改善由ERS诱导剂所致的NIT-1活力下降及细胞死亡。综上所述,我们的研究表明:与正常饮水组相比,持续饮用甘露糖溶液短期内,即可明显改善NOD小鼠胰岛炎症,外周T淋巴细胞频率总体上也有一定程度减弱,但对于外周Treg产生的影响在持续处理较长时间后才出现。因此,我们推测NOD小鼠饮用甘露糖短期内产生的胰岛保护效应并非依赖Treg上调,而存在其他作用机制。进一步研究发现,持续饮甘露糖溶液2、3、7周可明显抑制NOD小鼠胰腺组织病理性ERS标志物TXNIP产生以及ERS标志物转录水平。同时短期内2-3周通过增加Eif2α蛋白磷酸化水平,以及在2周降低Ire1蛋白磷酸化表达量,可以减轻ER中未折叠蛋白质的负荷,减少早胰腺ERS反应性死亡,适度改善生理性ERS,以恢复细胞内稳态;但随着时间延长,甘露糖可以显著抑制胰腺组织持续性ERS引起的Eif2α、Ire1蛋白磷酸化水平增加,以防止向病理性ERS转变。最后在体外培养体系中,进一步证明甘露糖可以有效抑制TM诱导的胰岛β细胞系过度ERS,恢复胰岛β细胞活力,减少β细胞死亡。本研究首次发现甘露糖可以通过调节ERS,改善胰岛炎症,从而为甘露糖保护T1D提供了新的作用机制和实验数据,为将来甘露糖临床应用奠定理论基础。