糖尿病性视网膜病变(DR)作为糖尿病全身微血管并发症在眼部较早呈现的表现,随着病程的发展可导致严重的视力损害,甚至在后期因眼底血管增殖性病变的出现而致盲,是现在医学领域亟待解决的四大致盲性眼病难题之一。本病的研究近年来是医学界的研究热点,但由于发病机制复杂,目前的治疗和预防手段均难以达到理想效果,目前尚无有效药物治疗品种,本研究开展的中药防治DR的研究可能在治疗DR形成突破,在糖尿病及其并发症防治方面取得重要的进展,可以在糖尿病性视网膜病变防治方面形成突破,甚至拓展国际大市场。本课题所在团队长期以祖国医学理论为指导,针对糖尿病患者发生眼部并发症过程里呈现出的气阴亏虚、目络瘀滞的基本中医病机,开展中药有效部位复方制剂治疗糖尿病性视网膜病变的开发研究。经过课题组前期研究已经明确芪灯明目胶囊是有效治疗本病的药物,能减少糖尿病性视网膜病变引起的盲和视力损害,本研究通过离体细胞实验、VEGF转基因斑马鱼、EGFR和p-STAT3信号通路蛋白表达三个层面针对芪灯明目胶囊有效成分抑制糖尿病视网膜新生血管的作用机制进行了实验研究,希望研究的结果能为糖尿病专科临床治疗指导提供有力的支撑,也能助力发挥中医治疗糖尿病并发症的优势和特点。第一部分：芪灯明目胶囊有效成分抑制体外新生血管实验目的：新生血管生成依赖于血管内皮细胞和细胞外基质的相互作用,因此血管内皮细胞已作为目前研究对抗血管生成治疗的独特靶细胞。本研究探讨芪灯明目胶囊有效成分对体外培养的血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用,为证明芪灯明目胶囊有效成分防治糖尿病视网膜新生血管的确切有效性提供实验依据。方法：观察芪灯胶囊与其3个单体化合物在细胞水平、组织水平对抑制微血管生成活性的影响。实验内容包括3个成分分别考察在多浓度剂量对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、脐内皮迁移、鸡胚尿囊膜微血管生成、大鼠动脉环微血管生成的影响。结果：实验结果显示各项实验中对照组细胞生长良好,用药组野黄芩素、葛根素与黄芪甲苷均在不同实验中显示出了明显的抑制内皮细胞生长的作用,并呈现剂量依赖性,总体评价野黄芩素和葛根素在抑制脐内皮细胞增殖的环节中作用较强,黄芪甲苷的作用较弱,在相同浓度情况下有野黄芩素>葛根素>黄芪甲苷趋势。第二部分：芪灯明目胶囊有效成分抑制VEGF转基因斑马鱼血管生成实验目的：VEGF是一种多功能的细胞因子,其主要作用是促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性,是各种生理、病理的血管生成的中心调控因素。前期实验证明芪灯明目胶囊有效成分具有明显的抑制内皮细胞生长的作用,在此基础上,创新性的选择‘’VEGF转基因斑马鱼”作为实验模型进行抑制血管生成实验,为进一步证明芪灯明目胶囊有效成分防治糖尿病视网膜新生血管的确切有效通路探索提供实验依据。方法：实验所用的斑马鱼为血管荧光转基因斑马鱼(VEGFR2:GFP)。斑马鱼的养殖和培育参照Westerfield[1]的方法。施药鱼胚胎于24hpf后取出,置于1μg·ml-1链霉蛋白酶溶液中数分钟后,用吸管吹去胚胎卵膜,将脱膜胚胎加入96孔板中,每孔一只；将试验药物加入96孔板中,分别设置对照组,葛根素组,黄芪甲苷组,野黄芩素组,每组分设3个浓度组,每个浓度各10个胚胎；加药后吸出鱼体放于载玻片上,在荧光显微镜下观察记录斑马鱼异常和节间血管并拍照,对体节间血管计数,计算抑制率。结果：表现出芪灯明目胶囊能明显抑制斑马鱼模型体节间血管生成。对照组中斑马鱼体节间血管生成良好,无缺失,无断裂,荧光强。作用后的斑马鱼,体节间血管缺失、断裂明显,血管数减少,荧光强度减弱。荧光血管计数显示,125μg·ml-1葛根素对斑马鱼体节间血管的抑制率为16.93%,具有显著性差异(p<0.05)；血管荧光计数结果显示葛根素组,野黄芩素125μg·ml-1组与150μg·ml-1组与对照组比较具有显著性差异(p<0.01)。从本实验结果来看,在血管计数方面,葛根素125μg·ml-1有明显抑制效果；但在荧光计数方面,野黄芩素有明显的效果,说明葛根素与野黄芩素在抑制作用靶点方面有不同。第三部分：芪灯明目胶囊有效成分抑制新生血管的机制研究目的：在第二部分斑马鱼实验中,明确了芪灯明目胶囊有效成分抑制新生血管生成通过VEGF通路有效,在此基础上为了更深入研究其起效机制设计本实验,选用前期效果最明显的芪灯明目胶囊两个成分“野黄芩素”与“葛根素”对多个血管生成关键信号p- 38、AKT、EGFR、STAT3、EKR1/2的磷酸化水平以及mmp-9蛋白表达的影响,探寻其血管生成关键信号通路蛋白表达的影响,探讨其分子机制,以进一步阐明芪灯明目胶囊有效成分的作用机制。方法：用培养皿做细胞培养,分别建立对照组,阿法替尼高中低3组(0.01μm、0.1μm、1μm)、.野黄芩素高中低3组(1μm、10μm、100μm)、葛根素(1μm、10μm、100μm)高中低3组,施药后9h结束实验,细胞总蛋白提取后使用Western Blot检测蛋白表达。结果：实验结果显示各目标蛋白在正常细胞内的磷酸化水平较低,经EGF刺激后,Akt、EGFR、ERK1/2、p-38、STAT3等蛋白的磷酸化水平显著升高(m组),在afatinib处理后,各组蛋白的磷酸化水平明显降低,并呈现明显剂量依赖；与对照组比较,野黄芩素与葛根素对STAT3的磷酸化抑制较为明显,具有一定浓度依赖性；可显著抑制EGFR蛋白的磷酸化,但对AKT、EKRR1/2、p-38的磷酸化水平无明显影响。结论：1.芪灯明目胶囊胶囊各组成成分在整体动物水平、器官水平和细胞水平确有抑制新生血管生成的作用,其中野黄芩素和葛根素的抑制作用较强。2.芪灯明目胶囊能明显抑制斑马鱼模型体节间血管生成,在血管计数方面,葛根素有明显抑制效果；但在荧光计数方面,野黄芩素有明显的效果,说明葛根素与野黄芩素在抑制作用靶点方面有不同。3.芪灯明目胶囊胶囊组成成分野黄芩素和葛根素可能是通过对STAT3和EGFR的磷酸化通路影响而产生新生血管抑制的作用,葛根素的作用强于野黄芩素。通过此项研究,有望为临床工作中糖尿病性视网膜病变的防治提供新的药物靶向与线索。