目的：本课题组通过实验已经证实香菇C91-3菌株菌丝体发酵液中的粗蛋白混合物成份LFP91-3在体内具有抑制肿瘤生长、体外直接杀伤肿瘤细胞的活性。本研究围绕分离纯化LFP91-3中高效的蛋白组分展开工作，已通过离子交换层析法分离得到一种单一的蛋白组分LFP91-3-A，并证实其在体外能显著抑制H22、S180肿瘤细胞的生长。分析其抗肿瘤机制可能与诱导细胞凋亡有关。在此基础上，继续分离纯化LFP91．3中其他有活性的蛋白组分并继续探索更好的分离纯化方法，从而易于得到更加有效的活性蛋白。本实验用凝胶过滤层析法对LFP91-3组分进行了分离纯化，并对提取蛋白进行了体外的抗肿瘤活性测定、初步的机制研究和鉴定实验。为减少粗蛋白中的组分从而利于活性组分的分离纯化，本实验还对延长发酵时间进行了尝试。 方法： （1）分离纯化：在4℃将香菇C91-3菌丝体发酵液的粗蛋白经盐析、透析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离。用考马斯亮蓝法测定各管收集液中的蛋白浓度，并依此绘制洗脱曲线。 （2）功能测定及初步鉴定：用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）分别测定各洗脱峰收集液在蛋白浓度为20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml时对S180肿瘤细胞的体外生长抑制活性，作用时间分别为24小时、48小时、72小时。对抑瘤率最大的第三洗脱峰各管收集液分别做SDS-PAGE电泳银染，对各管洗脱液中蛋白质的纯度和分子量进行测定。取电泳条带相对较单一的峰尖部数管收集液合并，浓缩后即为本实验的提取蛋白，将其配成不同浓度（5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml），以MTT法分别测定其对S180肿瘤细胞的体外生长抑制活性，作用时间同上。用考马斯亮蓝法和硫酸-苯酚定糖法测定提取蛋白中蛋白和糖的比例。 （3）机制分析：不同浓度的（20ug/ml，30ug/ml，40ug/ml）提取蛋白对S180肿瘤细胞分别作用24小时，流式细胞仪检测其诱导肿瘤细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率以分析其可能的抗肿瘤机制；透射电镜对经该蛋白作用的S180肿瘤细胞进行细胞凋亡的形态学观察。 （4）本实验所用发酵液的发酵时间较以前课题组成员所用时间延长3-4天。 结果： （1）香菇菌C91-3菌丝体发酵液的粗蛋白LFP91-3经盐析、透析、Sephadex G-100凝胶层析，用Microsoft Excel软件绘制洗脱曲线，可得Ⅰ-Ⅳ4个洗脱峰，经MTT法测定各峰收集液的抑瘤率，得第三洗脱峰的收集液抑瘤率最高。SDS-PAGE电泳结果显示第三洗脱峰顶部23-26管收集液主要含有分子量为19kDa左右的蛋白，其他分子量的蛋白含量极低。考马斯亮蓝法和硫酸-苯酚法显示该蛋白中蛋白和糖比例约为3：1。 （2）MTT法显示蛋白在体外能明显抑制S180肿瘤细胞活性，其抑瘤率随蛋白浓度的增加和作用时间的延长而随之升高，呈浓度和时间的依赖性。20ug/ml提取蛋白作用48小时，对S180细胞的活性抑制率为36．5%；提高浓度至30ug/ml提取蛋白作用48小时，S180细胞的活性抑制率为47．8%；当浓度为40ug/ml，延长作用时间至72小时，对S180细胞的活性抑制率可达76．7%。 （3）Annexin/PI双染色法染色，流式细胞仪测定S180肿瘤细胞的凋亡率结果表明提取蛋白能在体外诱导S180细胞的凋亡，不同浓度的提取蛋白（20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml）作用S180细胞24小时，S180细胞的总凋亡率（早期+晚期）分别为1．38%、1．59%、2．17%，与阴性对照0．71%相比具有显著性差异。肿瘤细胞的凋亡率随着提取蛋白的作用浓度增大而增大，表现出剂量-效应关系。透射电镜下观察经提取蛋白作用的S180细胞，可见细胞皱缩、细胞核固缩和染色质浓集、边集等典型凋亡细胞形态，亦可见凋亡小体。 （4）延长发酵时间后得到的产物与前人相比，蛋白组分有所减少，分子量也有所降低。 结论：香菇C91-3菌丝体发酵液的粗蛋白LFP91-3经盐析、透析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离共得到四组蛋白，其中第一组和第三组在体外对S180细胞的生长具有较强的抑制作用。第三组的抑制作用最强，位于该组洗脱峰顶部的23-26管收集液主要含有分子量为19kDa左右的蛋白，而且含有四分一的糖成分，提示可能为糖蛋白。该提取蛋白对S180细胞的生长具有较强的抑制作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。