论文部分内容阅读
根据已报道的CMV基因序列，设计通用引物，通过RT-PCR扩增了CMV P3613株系的RNA2片段和MP基因片段及AN株系的CP基因片段，并分别克隆到pBluescript SK(-)载体上。根据克隆得到的序列，设计新的引物，在CP基因5′端用引物引入限制性内切酶位点Bsp120Ⅰ：在RNA2片段的5′端引入限制性内切酶位点Bsp120Ⅰ，3′端引入限制性内切酶位点KpnⅠ；在MP基因的5′端引入限制性内切酶位点Bsp120Ⅰ，3′端引入限制性内切酶位点PsyⅠ。利用分子克隆的常规方法，以CP基因作为中间序列，以PGEM为中间载体，构建了两个分别具有RNA2片段和MP基因反向重复片段的原核表达载体。通过PCR、酶切、测序等方法验证，均表明构建的重组载体与预期相同。 具有反向重复片段的原核表达载体通过离体转录验证，能够转录出与预期构建大小相同的片段。将具有反向重复片段的原核表达载体转化大肠杆菌菌株HT115(DE3)，经过IPTG诱导表达，破碎细胞提取到了与预期构建大小相同的片段，经过DNase和RNaseA的酶切鉴定，证实为表达的dsRNA。用能够表达dsRNA的细菌破碎后处理烟草进行攻毒的实验分为2组，每组分为相同的10个处理。接种病毒7天后采用RT-PCR方法检测。第一组先接种细菌7d后接种CMV，结果除了接种表达dsRNA的细菌的烟草抗CMV，还有另外两个处理可能因为接种方法的问题而表现无病毒。第二组先接种CMV 1h后再接种细菌的结果也是接种表达dsRNA的细菌的烟草抗CMV。两组结果证明：细菌表达的dsRNA能够诱导烟草对CMV产生抗性。 本论文的研究结果证实：利用转录后基因沉默(PTGS)的原理，构建具有反向重复序列的原核表达载体，将此载体在特定的细菌菌株中诱导表达的dsRNA粗提取物处理烟草，可诱导植物对病毒的抗性。