论文部分内容阅读
氨酰-tRNA合成酶是有机体生命进化过程中最早出现的一类蛋白质。近年来研究表明,氨酰-tRNA合成酶除了通过两步特异性反应催化氨基酸与它同源的tRNA相结合外,还参与基因表达调控、调节rRNA合成、RNA剪切细胞因子和抑制细胞凋亡等许多的生命活动。本研究的目的是获得人线粒体色氨酰-tRNA合成酶,并用体外转录的人线粒体tRNATrp对其活力进行测定。为进一步研究该酶的结构、功能以及氨酰-tRNA合成酶的种属特异性氨酰化奠定了基础。采用RT-PCR法从人乳腺癌细胞(MDA-MB-435S)总RNA中获得编码人线粒体色氨酰-tRNA合成酶(hmtTrpRS)的全序列,并将此片断连接到克隆载体pMD18-T中,构建了克隆载体pMD18-hmtTrpRS,然后经过限制性内切酶NedⅠ和EcoRⅠ双酶切,酶切产物连接到表达载体pET-24a(+)中,经过抗性筛选、分子量大小比较、双酶切鉴定和PCR鉴定等多种方法验证,得到了人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的高表达质粒pET-24a(+)-hmt TrpRS。筛选出阳性重组子转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL诱导表达。分析了异丙基硫代p—D—半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导时间和诱导温度对融合蛋白表达的影响。结果表明诱导蛋白表达较合适条件为IPTG浓度为0.1 mmol/L,30℃诱导4h,所表达的蛋白质其分子量与理论值38 KDa相符。在特异性的Ni2+亲和柱的帮助下,分别纯化了以包涵体和可溶蛋白形式存在的目的蛋白,获得了纯度均达到95%以上的含6个His标记的人线粒体色氨酰-tRNA合成酶融合蛋白。通过两步PCR法成功构建了人线粒体tRNATrp基因,并成功进行了转录,制备了人线粒体tRNATrp。测定了纯化可溶蛋白得到的人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的氨酰化活力。利用lineweaver-Burk作图法计算出人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的动力学常数Km为1.08μmol/L,kcat为0.02S-1,蛋白纯品的比活为4411.18 U/mg综上所述,本研究从人乳腺癌细胞(MDA-MB-435S)中克隆得到了人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因,成功构建了表达载体pET-24a(+)-hmt TrpRS,并在大肠杆菌中获得了高效表达。进一步通过Ni亲和柱层析得到蛋白纯品后,并以体外转录得到的人线粒体tRNATrp为底物,对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的氨酰化活力进行了测定,取得较理想结果。