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环状糊精是淀粉经酶降解环化而成的具有筒状疏水内腔的产物,合成大环糊精的酶有麦芽糖转糖基酶。由于其在生物体内的含量很低,无论作为研究来源还是用于制备大环糊精,都不能满足实际需求。本文从Streptomyces ssp. ST66中扩增到麦芽糖转糖基酶(Mal Q)基因,构建了一株基因工程菌E.coli BL21/ pET-GST-Mal Q,并成功得到表达。对表达产物进行了初步分离纯化,并催化直链淀粉合成大环糊精。研究了影响基因工程菌发酵产酶相关因素,主要结论如下:(1)用PCR方法扩增Streptomyces ssp. ST66 Mal Q基因,将该基因插入原核表达载体pET-GST中,测序后发现开放阅读框(ORF)全长2133 bp,编码711个氨基酸,分子量为76.56 kDa。在GenBank中经BLAST比对,与报道的Streptomyces coelicolor Mal Q基因同源性高达97%。重组质粒转化E.coli BL21,构建基因工程菌E.coli BL21/pET-GST-Mal Q,经IPTG诱导表达目的蛋白。离心收集离心收集并利用超声波破碎细胞,将细胞破碎液进行SDS-PAGE电泳,结果表明Mal Q基因成功得到表达,且表达产物属于胞内酶；将粗酶液作用于麦芽二糖,反应液经薄层色谱分析,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。(2)通过亲和色谱,纯化得到目标蛋白。使用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶切割融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白在约76 kDa处有一明显条带。以粗酶液处理直链淀粉,并采用淀粉酶水解上述反应液,发现反应液中含有较高的抗葡萄糖淀粉酶水解的淀粉。经TLC检测,证实了诱导表达的粗酶液能够催化直链淀粉环化成大环糊精。(3)优化了E.coli BL21/pET-GST-Mal Q的产酶工艺条件。最佳诱导条件为诱导时间5 hr,诱导温度35℃,初始细胞量(OD6000.8),诱导剂IPTG终浓度0.9mmol/L,转速150 rpm。在最佳诱导条件下,基因工程菌的酶活达2.84 U,而Streptomyces ssp. ST66的酶活仅为0.31 U,基因工程菌产酶的酶活提高了9.16倍。