一、研究背景多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种常见的妇女内分泌和代谢紊乱性疾病,以无排卵、少数稀发排卵、雄激素过多和多囊样卵巢为主要特征。PCOS与肥胖关系密切。目前,介导PCOS的关键病理生理机制尚未阐明,尚无针对PCOS的有效药物。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,A-FABP)属于脂肪酸结合蛋白家族,是一种主要由脂肪细胞和巨噬细胞分泌的代谢调控因子。A-FABP参与细胞内脂肪酸信号传导,与多种代谢及炎症相关疾病密切相关。外周血A-FABP水平在PCOS患者中较健康对照女性显著升高。目前对于A-FABP调控PCOS的病理生理功能和分子机制尚未见报道。复方贞术调脂方(FTZ)是本研究中心学科带头人郭姣教授领衔团队创立的中药复方。前期研究显示FTZ具有改善胰岛素抵抗、降血糖、抗炎等作用。目前对于FTZ干预PCOS的作用和机制尚不明确。研究A-FABP调控实验性PCOS的功能,对于揭示PCOS的病理生理机制和阐明中药复方FTZ干预PCOS的作用机理具有重要的科学意义。二、研究目的1.基于PCOS的关键临床特征,联合高脂饮食喂养和来曲唑诱导,通过生殖和代谢表型鉴定,评价该模型是否可作为研究A-FABP在PCOS发生中病理生理学功能的小鼠模型;2.基于基因功能缺失(loss-of-function)策略,应用A-FABP敲除小鼠和野生型对照小鼠,诱导PCOS模型,研究A-FABP在PCOS诱导小鼠模型中的卵巢形态、功能和系统性代谢功能稳态中的病理生理功能;3.研究A-FABP化合物抑制剂(pharmacological inhibitor)对实验性PCOS的干预作用;4.研究中药复方贞术调脂方对于实验性PCOS的干预作用。三、研究策略和方法1.以高脂饮食和来曲唑联用方案,建立PCOS小鼠模型雌性、4周龄野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠经高脂饮食(High Fat Diet,HFD)和皮下植入来曲唑(Letrozole)缓释药片(50μg/天)造模5周,诱导PCOS。造模过程中,每周检测体重;运用阴道细胞学方法,评价发情周期;运用H&E方法评价卵巢组织病理学变化;通过检测血清中雄、雌激素水平评价小鼠体内激素水平分泌变化;通过空腹血糖、葡萄糖耐量实验评估葡萄糖代谢水平;通过身体组分分析仪定量体内脂肪、肌肉含量以评价小鼠系统脂代谢。2.A-FABP介导PCOS的病理生理功能研究基于基因功能缺失(loss-of-function)策略,比较A-FABP基因敲除(A-FABP knockout,A-FABP KO)和野生型对照(wild type,WT)小鼠的PCOS表型特征。雌性、4周龄A-FABP KO和WT小鼠按照第1部分建立的方案诱导实验性PCOS。采用与第1部分相同的评价指标鉴定A-FABP和WT的表型,以揭示A-FABP在PCOS发病中的病理生理功能。3.A-FABP抑制剂对小鼠实验性PCOS的干预研究雌性、4周龄野生型小鼠按照第1部分建立的方案诱导实验性PCOS。造模期间,以A-FABP抑制剂(BMS309403)干预野生型小鼠PCOS模型(15mg/kg?体重/天,溶于4%吐温80),连续灌胃35天;对照组每日灌胃等体积的4%吐温80(vehicle)。采用与第1部分相同的指标评价BMS309403对于PCOS的干预效果。4.中药复方贞术调脂方对小鼠实验性PCOS的干预研究雌性、4周龄野生型小鼠按照第1部分建立的方案诱导实验性PCOS。造模期间,以复方贞术调脂胶囊内容物(剂量:2.892 g/kg?体重/天)通过连续灌胃方式干预野生型小鼠PCOS模型,共给药35天;对照组以等体积的纯水每日灌胃。采用与第1部分相同的指标评价复方贞术调脂方对于PCOS的干预效果。四、研究结果1.高脂饲料联合来曲唑方案可诱导符合PCOS关键临床特征的小鼠模型经高脂饮食联合来曲唑方案诱导PCOS模型,模型小鼠表现出多个典型的PCOS样特征,包括发情周期紊乱、卵巢组织解剖结构呈病理性改变,囊状卵泡数量增加,黄体数量减少等,符合PCOS患者无排卵和稀发排卵、多囊样卵巢等临床表现。小鼠雌激素明显降低,雄激素略升高,部分符合PCOS患者内分泌紊乱表现。此外,在高脂饮食喂饲条件下,小鼠出现肥胖、糖耐量受损等代谢异常表型,符合PCOS患者肥胖和胰岛素抵抗等代谢紊乱特征(n=6,详见第三章)。2.A-FABP在PCOS卵巢颗粒细胞中具有特异性高表达以Western blotting半定量PCOS小鼠模型卵巢组织中A-FABP水平,发现A-FABP蛋白水平在PCOS小鼠卵巢中较正常对照组显著升高。免疫组化染色和免疫荧光染色结果显示,PCOS小鼠模型卵巢组织A-FABP信号特异性集中在卵巢颗粒细胞(n=6,详见第四章)。3.A-FABP敲除小鼠的实验性PCOS较野生型小鼠显著减轻与野生型对照小鼠相比,A-FABP敲除(A-FABP knockout,A-FABP KO)小鼠卵巢组织PCOS样病理学特征显著减轻,包括囊状卵泡数量减少、黄体数量增加。同时,A-FABP KO小鼠中PCOS诱发的发情周期紊乱较野生型对照组明显改善。A-FABP KO小鼠外周血雄激素水平较野生型对照小鼠略下降,葡萄糖不耐受改善(n=6,详见第五章)。4.A-FABP化合物抑制剂显著改善小鼠实验性PCOS野生型PCOS模型小鼠经A-FABP特异性抑制剂BMS309403干预后,PCOS诱发的发情周期紊乱和卵巢组织组织病理学学特征显著改善,雌激素升高至正常水平。BMS309403治疗组小鼠葡萄糖不耐受显著改善(n=6,详见第六章)。5.复方贞术调脂方对小鼠PCOS具有保护作用与PCOS空白对照组相比,复方贞术调脂方干预显著改善小鼠PCOS诱发的发情周期紊乱;PCOS样卵巢组织病理学特征,包括囊状卵泡数量减少和黄体和窦卵泡数量增加,显著改善;在内分泌功能方面,经复方贞术调脂方干预治疗后小鼠雄激素下降,雌激素恢复正常水平,均具有显著性差异;在代谢方面,与野生型模型组小鼠相比,经复方贞术调脂方干预治疗后小鼠空腹血糖显著性下降;葡萄糖耐受性增强;体重和体脂量显著性下降(n=6,详见第七章)。五、结论1.高脂饮食联合来曲唑方案诱导的小鼠PCOS模型可模拟临床PCOS的关键组织病理学特征和部分代谢异常,可作为研究PCOS发病机制的可靠动物模型。2.A-FABP表达水平在PCOS小鼠卵巢中显著增加,在卵巢颗粒细胞中具有选择性高表达。3.A-FABP敲除导致的A-FABP缺失和以化合物抑制剂阻断A-FABP均可显著改善小鼠实验性PCOS。4.中药复方贞术调脂方对小鼠PCOS具有保护作用。综合以上研究结果,本课题揭示了A-FABP在介导小鼠实验性PCOS中发挥重要病理生理功能;中药复方贞术调脂方可有效保护小鼠实验性PCOS。因此,本课题数据支持A-FABP是针对PCOS新药和新型干预策略的潜在靶点。