蛹虫草醇溶蛋白分离纯化与生理活性的研究

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本试验探索蛹虫草醇溶蛋白的提取工艺、沉淀工艺、分离纯化路径,研究蛹虫草体内醇溶蛋白的种类和特征,探索蛹虫草醇溶蛋白生理生化活性。本研究结果可使人们对蛹虫草醇溶蛋白的种类和特性有较明确的了解,为蛹虫草醇溶蛋白的开发利用提供理论依据。   本试验的主要内容有:(1)以深圳彭源生物技术公司培育的蛹虫草为材料,以乙醇为提取剂,采用摇床温育的方式提取其体内的醇溶蛋白。通过单因素实验和正交实验探索提取时间、料液比、乙醇浓度、pH值和温度等因素对醇溶蛋白提取效率的影响,并筛选出最佳的蛹虫草醇溶蛋白提取工艺;(2)采用冷水稀释沉淀法研究加水比例、pH值和沉淀时间对蛹虫草醇溶蛋白的沉淀工艺的影响,筛选出最佳的蛹虫草醇溶蛋白沉淀工艺;(3)通过葡聚糖凝胶层析、离子交换柱层析以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等手段对蛹虫草醇溶蛋白进行分离纯化;(4)通过紫外吸收光谱和荧光发射光谱等光谱分析初步研究所得到的醇溶蛋白的分子结构;(5)从蛹虫草醇溶蛋白与乙醛的相互作用、还原力、对DPPH自由基(DPPH·)的清除作用、超氧阴离子(·O)自由基的清除作用和羟基自由基(·OH)的清除作用等这几个方面来研究蛹虫草醇溶蛋白的体外生理活性。   研究取得的主要结果有:   1.先进行单因素试验,然后通过正交试验筛选出蛹虫草醇溶蛋白最佳提取工艺条件为:料液比1:60、乙醇浓度50%、pH值10、温度45℃、提取时间为3h。在此条件下得到的蛹虫草醇溶蛋白提取率为21.86%(干重);从外观上看,得到的蛹虫草醇溶蛋白提取液呈橘黄色状,微粘稠,带有蛹虫草的香味。   2.经过正交试验筛选出蛹虫草醇溶蛋白最佳沉淀工艺条件为:加水比例为20:10、pH值6、沉淀时间为2.5h。在本沉淀工艺条件下,沉淀率为81.32%,蛋白纯度为72.83%:从外观上看,蛹虫草醇溶蛋白的真空冷冻干燥品为橘黄色饼状,均匀、有蛹虫草香味,产品复溶性好。   3.在纯化过程中,样品经过葡聚糖Sephadex G-150分离纯化得到数个蛋白峰,其中第一个峰称为蛋白峰Ⅰ。将蛋白峰Ⅰ组分进一步用DEAE-DE52阴离子交换柱层析分离纯化,最后得到一种纯的醇溶蛋白。SDS-PAGE分析结果显示,这种醇溶蛋白由一条肽链组成,其分子量约为65000 Da。   4.从紫外吸收光谱和荧光光谱的研究结果可知,所研究的蛹虫草醇溶蛋白在270nm-280 nm处的紫外特征吸收并不强烈,在Trp(色氨酸)的特征发射波长下的荧光强度不高,说明蛹虫草醇溶蛋白中含有的色氨酸(Trp)相对较少。   5.通过对蛹虫草醇溶蛋白和乙醛溶液混合物进行紫外光谱扫描,蛹虫草醇溶蛋白总蛋白和乙醛溶液混合后发生了作用。因而可推测,蛹虫草醇溶蛋白中的某些片段是乙醛的靶结构。   6.蛹虫草醇溶蛋白具有一定的还原力和清除自由基的能力。其中,对DPPH.自由基清除作用而言,蛹虫草醇溶蛋白总蛋白最大清除率达到75.79%,经Sephadex G-150分离的蛋白峰Ⅰ组分的最大清除率达到80.92%。对超氧阴离子(·O)自由基的清除作用而言,蛹虫草醇溶蛋白总蛋白的最大清除率达到9.16%,Sephadex G-150分离的蛋白峰Ⅰ组分的最大清除率达到16.25%。对羟自由基(·OH)的清除作用而言,蛹虫草醇溶蛋白总蛋白的最大清除率达到69.70%,Sephadex G-150分离的蛋白峰Ⅰ组分则未检测出有清除能力。   从本实验结果来看,蛹虫草中醇溶蛋白的含量较高,其含量达到干重21.86%。蛹虫草醇溶蛋白的种类比玉米和禾谷类作物醇溶蛋白的种类少,分子中色氨酸含量也相对较少。但蛹虫草醇溶蛋白的分子量相对较大。从其生理活性方面来看,蛹虫草醇溶蛋白可作为解酒剂和抗氧化剂使用,因而具有重要的开发应用价值。
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