厌氧脱色高通量评估体系的构建及其应用研究

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针对目前基于厌氧瓶的微生物降解评估方法效率低、操作繁琐等缺点,本论文结合96孔板的高通量特性及酶标仪的自动检测功能,利用染料充当电子受体和指示剂,构建了一种新型的厌氧脱色高通量无损评估体系。利用此体系评估了c型细胞色素CymA在模式产电微生物Shewanella oneidensis MR-1胞外呼吸中的作用,以及S.oneidensis MR-1对不同偶氮染料的胞内外降解特性。论文主要研究内容如下:  (1)基于96孔板与酶标仪,构建生物厌氧脱色高通量评估体系。在96孔板中,将待评测微生物菌株接种于含染料污染物的脱色培养基中,并于厌氧条件下密封培养。以酶标仪作为自动检测器,对染料浓度变化进行实时无损监测。利用该体系评估了S.oneidensis MR-1野生型及Mtr通路蛋白缺失型突变体(△mtrA、△mtrB、△mtrC/omcA以及△cymA)对指示性偶氮染料甲基橙的厌氧脱色效能,验证了所构建的高通量无损评估体系具有可行性。  (2)探讨了CymA在S.oneidensis MR-1胞外电子跨膜传递中的作用。针对目前CymA对Mtr电子跨膜传递通路的作用研究中所存在的争论,本论文以S.oneidensis MR-1及Mtr通路蛋白缺失型突变体为研究对象,以染料苯胺蓝和甲基橙作为胞外呼吸的电子受体,证实了CymA对Mtr通路的重要性受胞外电子受体种类、电子受体浓度以及胞外电子传递速率等因素的影响。这些因素本质上影响的是CymA到Mtr通路的电子传递,CymA的重要性也随Mtr通路对其电子传递需求的增加而加大。  (3)评估了Mtr通路对偶氮染料的胞内、胞外降解脱色效能。利用两种结构不同的偶氮染料甲基红和苋菜红进行S.oneidensis MR-1降解的评估。结果表明,甲基红主要是胞内降解,Mtr通路对其降解影响作用较小。而苋菜红则因为分子极性较大难进入细胞,主要依赖于Mtr通路跨膜传递的电子进行还原,其降解受Mtr通路的影响较大。胞外电子递质核黄素对甲基红的胞内降解无显著影响,却能加速苋菜红的降解。电子竞争剂NO2-对甲基红与苋菜红的降解均有抑制作用,而NO3-与TMAO却只能抑制苋菜红的降解。这些结果显示S.oneidensis MR-1的Mtr通路对电子受体的胞内、胞外降解影响不同,其中Mtr通路在S.oneidensisMR-1胞外降解中的作用更为重要。
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