肉鸡猝死综合征(Sudden Death Syndrome,SDS),以营养良好、看似健康的肉鸡突然而短暂地拍打翅膀后快速死亡为特征,该病的发生无明显季节性。SDS是肉鸡常见的与心脏功能紊乱相关的疾病,也是导致肉鸡死亡的主要非传染性原因之一,其发病率为0.5-5%,给家禽养殖业造成重大经济损失。由于SDS发病急且没有明显的临床症状,导致新鲜临床病例获取困难,基于文献报道和课题组前期蛋白质组学测序结果发现,快大型肉鸡在较大的代谢压力下,较易发生酸碱平衡紊乱。与健康肉鸡相比,死于肉鸡猝死综合征的肉鸡血液中乳酸含量显著升高。乳酸作为糖酵解的主要产物,在代谢压力及应激的情况下会加重乳酸堆积进而改变机体p H,导致心肌细胞发生酸中毒和细胞损伤。因此,本研究利用酸中毒心肌细胞损伤模型探讨SDS发生时心肌损伤机制。课题组前期发现SDS肉鸡心肌纤维排列紊乱、断裂,线粒体出现动力学紊乱及结构性损伤。为深入探究SDS发生原因和机制,拟从以下几个方面进行研究。1.乳酸对鸡胚原代心肌细胞损伤作用的研究培养鸡胚原代心肌细胞,优化细胞分离培养条件并建立乳酸酸中毒细胞模型。以10 mM、20 mM及40 mM乳酸处理心肌细胞,收集细胞,进行后续试验。利用(1)光学显微镜观察乳酸处理24 h后心肌细胞形态及心肌细胞收缩频率的变化;(2)流式细胞术及Western blot(WB)检测乳酸处理后心肌细胞的凋亡情况;(3)透射电镜观察细胞内线粒体数量的变化;(4)流式检测乳酸处理后心肌细胞线粒体膜电位水平变化;(5)WB检测心肌细胞线粒体动力学相关蛋白Drp 1、Fis 1、Opa 1、Mfn 2蛋白的表达水平;(6)ROS检测试剂盒检测乳酸对心肌细胞内ROS水平的影响;(7)透射电镜及WB检测乳酸对心肌细胞线粒体自噬的影响。结果发现:不同浓度乳酸处理肉鸡原代心肌细胞后,(1)与对照组相比,随着乳酸浓度的增加,乳酸处理组肉鸡原代心肌细胞立体感逐渐消失,折光性逐渐降低,心肌细胞收缩频率显著降低(P<0.01);(2)乳酸处理心肌细胞24 h后,心肌细胞中DNA损伤修复酶PARP-1显著下调,细胞凋亡关键蛋白cleaved Caspase-3的表达量明显下调(P<0.01),流式结果显示,心肌细胞凋亡率随乳酸浓度的增加而显著增加(P<0.01);(3)超微结构结果表明,乳酸可改变鸡胚原代心肌细胞线粒体形态并显著减少线粒体数量(P<0.01);(4)乳酸可导致线粒体膜电位显著下降(P<0.01);(5)WB结果显示,乳酸处理心肌细胞后均可上调线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的表达水平(P<0.01),且呈时间依赖性;而融合蛋白Mfn2和Opa1的表达水平则随着时间的延长明显下调(P<0.01);(6)乳酸处理细胞24 h后,ROS水平升高,在40 mM时显著高于对照组(P<0.01);(7)与对照组相比乳酸处理组细胞内自噬体数量显著增多,且p62表达量显著下调、LC3表达量显著上调(P<0.01)。2.抑制线粒体分裂对乳酸导致的心肌细胞损伤的保护作用为进一步研究线粒体分裂融合对心肌细胞的影响,选用5μM Mdivi-1(mitochondrial division inhibitor 1,线粒体分裂相关蛋白Drp1的抑制剂)与不同乳酸浓度共同处理心肌细胞研究Drp1对心肌细胞损伤的影响。利用(1)CCK-8测定抑制线粒体分裂对心肌细胞存活率的影响;(2)免疫荧光观察抑制线粒体分裂后线粒体网络化状态;(3)WB检测cleaved Caspase-3表达量的变化;(4)抑制线粒体分裂后检测心肌细胞ROS水平的变化。结果发现:利用Mdivi-1抑制心肌细胞线粒体分裂后,(1)Mdivi-1可降低乳酸导致的心肌细胞死亡率;(2)用20 mM乳酸和Mdivi-1共同处理心肌细胞后,可以有效恢复细胞内线粒体之间的网络状态;(3)cleaved Caspase-3在未处理组和Mdivi-1单独处理组细胞中表达水平相对较低且无明显变化;经乳酸单独处理后,cleaved Caspase-3的表达水平显著增加(P<0.01),与乳酸单独处理组相比,Mdivi-1与乳酸共同处理组中cleaved Caspase-3的表达显著降低(P<0.05);(4)与乳酸单独处理组相比,Mdivi-1可使乳酸处理组的心肌细胞中ROS明显降低。3.建立肉鸡猝死综合征模型根据酸中毒体外模型结果,利用氯化铵灌胃初步建立了肉鸡猝死体内模型。(1)检测肉鸡动脉血p H、血清碳酸氢盐浓度和二氧化碳动脉分压情况;(2)观察对照组和模型组肉鸡临床症状;(3)剖检肉鸡的心脏病变;(4)通过病理组织学检查肉鸡心脏的病理变化。结果显示:肉鸡猝死体内模型结果显示:(1)与对照组相比,肉鸡猝死模型血液p H、血清碳酸氢盐浓度和二氧化碳分压均显著下降(P<0.05);(2)对照组肉鸡外观健康,精神状态良好,采食正常;而模型组肉鸡多表现为精神不振且有猝死发生,发生猝死的肉鸡表现为突然失去平衡,煽动翅膀,尖叫;(3)猝死肉鸡解剖可见心脏体积明显扩张,且有大量的心包积液;肺脏淤血肿胀,呈暗红色;(4)病理组织学检查结果显示,猝死肉鸡心肌细胞发生颗粒变性、肌纤维断裂,心肌细胞间出血。以上结果表明乳酸可使原代心肌细胞收缩频率减低、形态发生改变、凋亡增加,线粒体结构损伤、膜电位降低、动力学异常、氧化应激水平升高、线粒体自噬增加;添加线粒体分裂抑制剂后,乳酸处理后的原代心肌细胞存活率升高、ROS水平降低,细胞凋亡减少,可有效保护心肌细胞和线粒体的结构与功能;利用氯化铵可以成功建立肉鸡猝死体内模型,初步复制出了肉鸡SDS的临床病例特征。体内和体外肉鸡猝死模型的成功建立,为SDS的防控奠定基础,并从比较医学的角度,为人类猝死疾病的机制研究提供思路。