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本论文以重组毕赤酵母(Pichia psatoris)KM71H(IFNα-pPICZαA)菌株为模式菌株,在摇瓶和10L发酵罐的条件下表达猪α干扰素(pIFN-α),考察了环境因素对pIFN-α浓度和抗病毒活性的影响。摇瓶实验结果表明,温度对pIFN-α的发酵性能影响显著。在10L发酵罐中,通过监测发酵过程状态参数,结合毕赤酵母利用甲醇的简化代谢模型,全面分析了温度对pIFN-α生产性能的影响。论文的主要研究内容与结果如下:(1)选取诱导温度、甲醇诱导浓度和pH为考察因子,设计实验方案,利用摇瓶培养毕赤酵母生产表达pIFN-α。诱导72h,上清液SDS-PAGE电泳分析结果表明,20℃低温诱导下的pIFN-α蛋白条带明显粗于30℃诱导的条带,说明低温诱导有利于pIFN-α的表达生产。利用凝胶图像分析仪扫描图像,诱导温度20℃、甲醇浓度20g/L、pH=5.5条件下,最高pIFN-α浓度可达0.19g/L。(2)在10L发酵罐和不同诱导温度下,进行了毕赤酵母高密度培养生产pIFN-α的发酵实验。运用工业生产中普遍使用的在线监测仪器,在线监测发酵过程的状态参数(甲醇比消耗速度、耗氧速度OUR、CO2生成速度CER、呼吸商RQ),发现不同诱导温度下上述参数存在较大差异。20℃时,细胞代谢活性高,甲醇比消耗速度快。结合使用细胞利用甲醇时的简化代谢模型进行代谢分析,结果表明,改变诱导温度可以导致胞内产能途径(途径A)和目标物质合成途径(途径B)的代谢流分配比例的改变。20℃下的低温诱导强化了走向pIFN-α合成途径的碳代谢流通量,与30℃诱导相比,发酵90 h时该代谢通量比例增加了67%。(3)使用普遍认可的以甲醇为底物的毕赤酵母简化代谢模型,结合发酵过程状态参数的在线测量,以及胞内氧化磷酸化途径中相关酶(NADH/NAD+)和高能磷酸化合物(ATP、ADP、AMP)的检测,对pIFN-α表达生产体系的能量运转机制进行了研究。计算分析表明,20℃低温诱导条件下,产能途径中所生成的NADH可以在产物合成途径中得到有效利用,产物合成途径中所需ATP的能量再生效率有所提高,ATP再生速度增加了6-24%,毕赤酵母发酵生产外源蛋白的整体效率得到改善。(4)10L发酵罐20℃诱导条件下的最高pIFN-α活性可达1.5×106IU/mL,是同体积发酵罐30℃诱导生产时最高活性(1×104IU/mL)的150倍。