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人生长抑素受体2亚型(hSSTR2)是生长抑素受体家族中介导生长抑素(SS)作用最重要的亚型,通常分布在正常细胞和神经内分泌肿瘤细胞表面。研究表明乳腺癌细胞膜亦有SSTRs的表达,但其表达丰度较低,可能与对生长抑素敏感性较差有关,上调SSTR2的表达能否挥抑制乳腺癌细胞的增殖有待探索。本研究构建了含hSSTR2基因的载体,转染MCF-7细胞,观察对乳腺癌细胞株MCF-7增殖与凋亡的影响,为以hSSTR2为靶点的乳腺癌治疗研究提供新思路。一、编码人生长抑素受体2亚型的真核表达载体pSIG的构建与表达鉴定借助PCR技术扩增获得hSSTR2全长基因序列,插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP/hSSTR2(pSIG)。菌落PCR、酶切鉴定及测序分析证实插入的hSSTR2 cDNA阅读框及连接部位序列正确。Real-time PCR、流式细胞术(FCM)以及免疫荧光技术确定hSSTR2在MCF-7细胞中的表达、定位。在mRNA水平,实验组hSSTR2的表达较对照组提高了2730倍;在蛋白水平,实验组hSSTR2表达阳性细胞百分率为49.67±1.35%,空白对照组及载体对照组仅为1.63±0.15%、2.33±0.75%。免疫荧光染色证实hSSTR2在MCF-7细胞膜上表达,EGFP表达于细胞浆中。二、hSSTR2抑制乳腺癌细胞增殖效应的研究在细胞培养体系中加入生长抑素类似物,配体与受体的结合触发了一系列生物学效应:1.对MCF-7细胞凋亡与细胞周期的影响:碘化丙叮(PI)染色FCM检测细胞凋亡,结果显示实验组为40.40±14.30%,对照组仅1.31±0.38%与10.09±6.18%;细胞周期分析显示实验组5.61%的细胞处于S期,而对照组分别有22.36%与32.52%的细胞处于S期,差异有显著性(P<0.01)。2 .对MCF-7细胞EGFR表达的影响:实验组细胞EGFR表达阳性率为64.53±10.05%,对照组分别为93.01±1.92%与92.14±1.49%,有显著性差异(P<0.01),提示hSSTR2的高表达可降低EGFR的表达。3.对EGF抗体刺激细胞生长的影响:加入不同生理浓度的表皮生长因子(EGF)刺激细胞,计算各组细胞的生长抑制率(IR%),发现空白对照组IR%为0±0%,载体对照组IR%依次为28.6±7.4%、40.4±6.5%、49.5±11.4%、60.6±14.3%、54.6±10.3%、42.1±9.7%。实验组IR%依次为70.5±11.1%、70.7±7.0%、81.1±3.6%、88.5±2.7%、86.5±2.5%、79.8±4.9%。在不同EGF浓度刺激下,三组细胞生长抑制率有显著性差异(P<0.01),提示hSSTR2的高表达可抵抗EGF刺激细胞生长的作用。三、重组腺病毒Ad-SIG的制备及表达鉴定将pSIG质粒中hSSTR2-IRES-EGFP基因亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中,获得pShuttle-CMV/SIG,经PmeⅠ酶切、去磷酸化后转化含pAdEasy-1的超感受态细菌BJ5183,细菌内同源重组构建腺病毒pAdEasy-1/hSSTR2-IRES-EGFP(Ad-SIG)。将Ad-SIG转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装、扩增、纯化、滴度测定。Ad-SIG重组腺病毒感染MCF-7细胞,激光共聚焦显微镜显示hSSTR2在MCF-7细胞膜定位表达,Real-time PCR、FCM检测显示不同MOI感染与hSSTR2表达水平呈线性关系。结论1.成功构建编码人生长抑素受体2亚型的真核表达载体pSIG;转染pSIG的MCF-7凋亡率增加,G1/S细胞周期阻滞,膜表面EGFR表达下调,且对EGF的刺激增殖作用反应低下;2.进一步成功制备了重组腺病毒Ad-SIG,并确定重组腺病毒能介导hSSTR2基因的正确表达,为进一步体内外效应和机制研究奠定了基础。